液体活检

目前液体活检在国内的应用情况如何？ 肿瘤的液体活检主要包括循环肿瘤DNA（即circulating tumor DNA，ctDNA）、游离肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）及外泌体（exosome）。众多研究表明三者与肿瘤的早诊、治疗、预后等均存在相关性。目前在临床应用最多的当属ctDNA检测。   正常人的体液内亦存在来自于机体正常细胞的游离DNA，简称循环游离DNA；在肿瘤患者体内，循环游离DNA不仅仅来自于正常细胞，还有一部分来自于肿瘤细胞，即ctDNA是循环游离DNA的一部分，因此我们可以通过检测ctDNA相关变异状态作为来自肿瘤细胞的标志物。目前临床肿瘤ctDNA检测最常见的应用领域为治疗方案选择及耐药监测。   由于ctDNA具有片段化程度高、丰度低等特点，其主流检测方法包括Cobas法、Super-ARMS法、高通量二代测序（NGS）及数字PCR。      Cobas检测：作为第一个被美国食品药品监督管理局（FDA）批准的ctDNA检测试剂盒，仅对血液ctDNA中的EGFR基因常见突变进行检测，在以上四种ctDNA常用检测方法中敏感度较低；   Super-ARMS法：仅对EGFR基因常见突变进行检测，其通过对传统扩增阻遏突变系统（Amplification Refractory Mutation System，ARMS）法的优化升级，灵敏度更高，可检测低至0.2%丰度的突变，并且于2018年通过中国药监局审批；   NGS：优点在于可同时检测多个基因相关变异，能在最短的时间内对患者肿瘤变异情况做出全面了解，缺点在于操作复杂，费用较为昂贵；   数字PCR检测：为目前最敏感的检测方法，可以识别低至0.03%的突变，但是缺点在于检测通量低，每次仅能检测一个位点，并且仅能检测已知位点的突变。  哪些情况下适合采用液体活检？ 要了解液体活检具体的应用场景，首先应明确液体活检的优劣势。   液体活检最大的优势在于微创、快捷，易于动态监测；一定程度上全面反映肿瘤整体变异状态，不受肿瘤异质性影响；适用人群更广泛，对于难以取得活检肿瘤组织或取得肿瘤组织不够基因检测的患者，液体活检提供了一个了解肿瘤基因变异状态的有效途径。   然而，液体活检最大的劣势在于其并非富集肿瘤的检材，大量的正常组织释放基因组DNA稀释了肿瘤来源的DNA，造成ctDNA突变丰度很低（一般低于1%），对ctDNA突变的检测无异于大海捞针，或者更形象地说：从一堆稻草（正常组织来源的循环游离DNA）中找一根针（来自肿瘤细胞的ctDNA）一样困难，因此对ctDNA的检测方法灵敏度提出了更高的要求。   1. 早期诊断   肿瘤的早期诊断其最大特点为肿瘤负荷很低，可能影像学上都没有明确的肿瘤病灶。此时血液中ctDNA的含量亦极低，普通针对ctDNA突变的检测难以满足早诊的要求。   值得庆幸的是，细胞从癌前状态向癌症发展过程中，DNA甲基化改变是贯穿整个恶性转化的表观遗传学改变。即使在肿瘤发展的最早期阶段，DNA甲基化模式也已经与正常细胞存在显著差异；其次，甲基化水平的改变是具有组织特异性的，即对甲基化进行检测及比对，能够进行器官溯源，发现到底是哪里可能会发生或已经发生了肿瘤。   因此，对ctDNA的甲基化水平进行检测，是一种有效的肿瘤早期筛查辅助手段。比如SEPT9基因甲基化检测试剂盒对结直肠癌诊断的敏感度及特异性可达74.8%及97.5%[1]，现在已经可以作为一种结肠镜前的初筛手段。   2. 指导靶向治疗   肿瘤的靶向治疗是目前临床最常见的ctDNA检测应用场景。根据《非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测中国专家共识》[2]，如果有肿瘤组织，推荐直接用肿瘤组织进行驱动基因检测；但是若没有肿瘤组织样本或者肿瘤组织样本不足的情况下，液体活检可作为很多患者基因检测的首选。   由于中国非小细胞肺癌人群中EGFR为最常见的驱动基因变异（约40%-55%），此时对肿瘤驱动基因的检测，既可以使用Cobas或者Super-AMRS法对EGFR基因常见突变进行检测，也可以使用NGS，一次性对所有肺癌相关驱动基因变异进行全面检测。   但无论是何种检测方式，应注意的是若组织活检或者液体活检有任何一个是阳性，患者就应当考虑使用靶向药物；当液体活检先行的时候，若液体活检为阴性，应提示患者可能存在假阴性，必要时再取活检，以避免错失可能的靶向治疗机会。   3. 耐药监测   靶向治疗终归面临耐药的问题，而液体活检由于微创快捷的优势，是理想的耐药监测材料。对于EGFR一代或者二代TKI用药人群，约半数以上的患者出现EGFR 20号外显子T790M而耐药[3]，因此对于此类患者的耐药监测可使用敏感度高且成本低的数字PCR法对T790M单点进行监测。如果患者已经出现了耐药，亟需探索其耐药机制以更换治疗方案，此时推荐使用NGS对基因变异的整体状态进行检测，以便全面寻找耐药原因。   4. 预后评估 […]

目前液体活检在国内的应用情况如何？ 肿瘤的液体活检主要包括循环肿瘤DNA（即circulating tumor DNA，ctDNA）、游离肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）及外泌体（exosome）。众多研究表明三者与肿瘤的早诊、治疗、预后等均存在相关性。目前在临床应用最多的当属ctDNA检测。   正常人的体液内亦存在来自于机体正常细胞的游离DNA，简称循环游离DNA；在肿瘤患者体内，循环游离DNA不仅仅来自于正常细胞，还有一部分来自于肿瘤细胞，即ctDNA是循环游离DNA的一部分，因此我们可以通过检测ctDNA相关变异状态作为来自肿瘤细胞的标志物。目前临床肿瘤ctDNA检测最常见的应用领域为治疗方案选择及耐药监测。   由于ctDNA具有片段化程度高、丰度低等特点，其主流检测方法包括Cobas法、Super-ARMS法、高通量二代测序（NGS）及数字PCR。      Cobas检测：作为第一个被美国食品药品监督管理局（FDA）批准的ctDNA检测试剂盒，仅对血液ctDNA中的EGFR基因常见突变进行检测，在以上四种ctDNA常用检测方法中敏感度较低；   Super-ARMS法：仅对EGFR基因常见突变进行检测，其通过对传统扩增阻遏突变系统（Amplification Refractory Mutation System，ARMS）法的优化升级，灵敏度更高，可检测低至0.2%丰度的突变，并且于2018年通过中国药监局审批；   NGS：优点在于可同时检测多个基因相关变异，能在最短的时间内对患者肿瘤变异情况做出全面了解，缺点在于操作复杂，费用较为昂贵；   数字PCR检测：为目前最敏感的检测方法，可以识别低至0.03%的突变，但是缺点在于检测通量低，每次仅能检测一个位点，并且仅能检测已知位点的突变。  哪些情况下适合采用液体活检？ 要了解液体活检具体的应用场景，首先应明确液体活检的优劣势。   液体活检最大的优势在于微创、快捷，易于动态监测；一定程度上全面反映肿瘤整体变异状态，不受肿瘤异质性影响；适用人群更广泛，对于难以取得活检肿瘤组织或取得肿瘤组织不够基因检测的患者，液体活检提供了一个了解肿瘤基因变异状态的有效途径。   然而，液体活检最大的劣势在于其并非富集肿瘤的检材，大量的正常组织释放基因组DNA稀释了肿瘤来源的DNA，造成ctDNA突变丰度很低（一般低于1%），对ctDNA突变的检测无异于大海捞针，或者更形象地说：从一堆稻草（正常组织来源的循环游离DNA）中找一根针（来自肿瘤细胞的ctDNA）一样困难，因此对ctDNA的检测方法灵敏度提出了更高的要求。   1. 早期诊断   肿瘤的早期诊断其最大特点为肿瘤负荷很低，可能影像学上都没有明确的肿瘤病灶。此时血液中ctDNA的含量亦极低，普通针对ctDNA突变的检测难以满足早诊的要求。   值得庆幸的是，细胞从癌前状态向癌症发展过程中，DNA甲基化改变是贯穿整个恶性转化的表观遗传学改变。即使在肿瘤发展的最早期阶段，DNA甲基化模式也已经与正常细胞存在显著差异；其次，甲基化水平的改变是具有组织特异性的，即对甲基化进行检测及比对，能够进行器官溯源，发现到底是哪里可能会发生或已经发生了肿瘤。   因此，对ctDNA的甲基化水平进行检测，是一种有效的肿瘤早期筛查辅助手段。比如SEPT9基因甲基化检测试剂盒对结直肠癌诊断的敏感度及特异性可达74.8%及97.5%[1]，现在已经可以作为一种结肠镜前的初筛手段。   2. 指导靶向治疗   肿瘤的靶向治疗是目前临床最常见的ctDNA检测应用场景。根据《非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测中国专家共识》[2]，如果有肿瘤组织，推荐直接用肿瘤组织进行驱动基因检测；但是若没有肿瘤组织样本或者肿瘤组织样本不足的情况下，液体活检可作为很多患者基因检测的首选。   由于中国非小细胞肺癌人群中EGFR为最常见的驱动基因变异（约40%-55%），此时对肿瘤驱动基因的检测，既可以使用Cobas或者Super-AMRS法对EGFR基因常见突变进行检测，也可以使用NGS，一次性对所有肺癌相关驱动基因变异进行全面检测。   但无论是何种检测方式，应注意的是若组织活检或者液体活检有任何一个是阳性，患者就应当考虑使用靶向药物；当液体活检先行的时候，若液体活检为阴性，应提示患者可能存在假阴性，必要时再取活检，以避免错失可能的靶向治疗机会。   3. 耐药监测   靶向治疗终归面临耐药的问题，而液体活检由于微创快捷的优势，是理想的耐药监测材料。对于EGFR一代或者二代TKI用药人群，约半数以上的患者出现EGFR 20号外显子T790M而耐药[3]，因此对于此类患者的耐药监测可使用敏感度高且成本低的数字PCR法对T790M单点进行监测。如果患者已经出现了耐药，亟需探索其耐药机制以更换治疗方案，此时推荐使用NGS对基因变异的整体状态进行检测，以便全面寻找耐药原因。   4. 预后评估 […]

绝大多数中晚期癌症，是不可治愈的疾病，就像慢性高血压、2型糖尿病，即使我们已经有相对可靠的药物，控制这类疾病，但是有一点依然无法避免，那就是需要长期服药。 不过，癌症和高血压、糖尿病等疾病毕竟又截然不同： ○ 部分不幸的病友，经过一段时间的治疗后，疾病控制不住而去世； ○ 少数幸运的病友，经过一段时间的治疗后，有可能实现肿瘤完全消失且维持一段时间。 对于这类少数的幸运儿，药物治疗是否有可能在一个合适的时机，安全地停止下来，从而实现临床治愈，这是近期研究的热门话题。 因为随着靶向药、免疫检查点抑制剂等新药不断出现，中晚期实体瘤患者的生存期不断延长，一直不间断地用药大概率会诱导耐药且“是药三分毒”，而且一直用药大部分病友无法耐受副作用。如何科学合理安全的停药，是众多中晚期病友梦寐以求的话题。 事实上，关于PD-1免疫治疗后实现完全缓解的病友或者用满2年后疾病没有进展的病友，是否可以安全停药，已经有众多的研究，欢迎大家温习：PD-1起效到底何时能停药：老问题，新答案 由于免疫治疗起效后，机体免疫系统会产生免疫记忆效应，因此对于一部分已经实现完全缓解或者用满2年疾病超级稳定的病人，目前部分专家是赞成有条件停药且密切随访的。 争议更大的是靶向药是否可以提前停药，还是必须“药不能停”/“一直吃到死”。 今年5月，《Cancers》杂志公布了一项有趣的回顾性研究的成果。研究者分析了461名BRAF突变的晚期恶性黑色素瘤、接受靶向药治疗（维罗非尼、达拉非尼+曲美替尼等）的患者，其中37人实现了病灶完全消失，幸运儿的比例是8%（不算太低了，双免疫治疗可以让晚期恶性黑色素瘤的完全缓解率提高到10-15%）。 26名患者实现完全缓解后再继续巩固一段时间后停药，11人一直吃药。中位随访19个月后（最长的病人是70个月）： ● 11个一直吃药的病人全部维持完全缓解的状态、没有人出现疾病复发转移； ● 26个提前停药的病人，只有4个病人依然维持完全缓解的状态，其他病人均出现了疾病复发转移。 那些提前停药、结果一段时间后出现肿瘤反弹的病人，再次用回原来的靶向药，60%的病人药物再次起效。 上述研究给我们启示： 【1】对于绝大多数病人，靶向治疗后实现肿瘤完全缓解，并不代表身体里真的已经毫无癌细胞，只是目前的医学手段有限、目前的影像学技术依然灵敏度有限，没有发现隐藏的、很小很少的癌细胞罢了。如果贸然停药，大部分病人在一段时间后依然会出现疾病反弹。 【2】靶向治疗后实现肿瘤完全缓解的病人中，的确有一部分病人，尽管比例并不高，停药后或许是可以长期维持的。 那么，如果将这些极端幸运儿挑选出来，让这些病人实现安全、可靠的提前停药呢？ 近期一个意大利的专家团队，给出了一个可能的解决方案：检测血液中肿瘤DNA（也就是ctDNA）。他们观察了24名服用靶向药接近5年，肿瘤实现完全缓解或者残留病灶很小且一直保持稳定，从而提前停药的晚期恶性黑色素瘤患者。停药后，中位随访了37.8个月（随访时间最短也有33.7个月，最长的41.9个月），结果发现：停药后，1年的无疾病进展生存率是70.8%，2年的无疾病进展生存率是58.3%。 同时他们发现： ● 那些在停药时，外周血中已经检测不到肿瘤DNA的病人，停药后绝大多数可以长期维持； ● 而那些停药时，外周血中依然有相当浓度的肿瘤DNA的病人，停药后大多数很快反弹——更重要的是，6名影像学判断肿瘤已经完全消失且外周血中检测不到肿瘤DNA的病人，截至目前，无1例停药后出现疾病反弹。 综上所述，对于长期接受靶向治疗，疗效达到了完全缓解，而且通过外周血ctDNA检测无法发现肿瘤DNA的病人，或许可以酌情考虑提前停药，定期复查的策略。 参考文献： [1]. LorenzaDi Guardo , Giovanni Randon, Francesca Corti, et al. Liquid biopsy andradiological response predict outcomes following discontinuation of targetedtherapy in patients with BRAF mutated […]

基因检测结果的准确性，始于“样本质控”

《自然·癌症》：液体活检用于免疫治疗获重大突破

要成功用靶向药物对抗癌症，需要使用针对“主干突变”的药物

它们勾勒出肺癌治疗的未来

当癌症反攻时，如何回击？

MSKCC团队发现，癌症患者血液中一半以上的突变来自于白细胞

美国临床肿瘤学会2019年会即将于5月31日-6月4日在美国芝加哥召开

免疫治疗疗效预测血检又进一步

  今年年初，萝卜医生曾推出3篇科普文章，解释肿瘤病友最常见、而又最困惑的10大专业名词，好评如潮。大半年过去了，萝卜医生将原来的3篇文章重新修订，整合成1篇长文，供大家温故知新。   肿瘤标志物：数值仅供参考，动态变化更有意义 除长在身体表面的肿瘤，大多数癌症都看不见、摸不着，那么怎么知道疾病的发展情况呢？总不能天天跑医院去做CT、核磁吧。 因此，几十年来，医学家发现了许许多多的肿瘤标志物（顾名思义，就是用来代表肿瘤的东西），大多是血液里的蛋白质，比如CEA、CA125、CA199、AFP、CA153、SCC、NSE等。这些蛋白质，一般都是癌细胞分泌到血液里的；可以通过血液中这些蛋白质的含量高低，来判断肿瘤的负荷。 但是，肿瘤标志物有3个重要的问题：   1：不是所有的肿瘤，都会分泌这些蛋白质 因此，存在一部分患者肿瘤已经很大，疾病已经很晚期，但是常见的肿瘤标志物一直都是正常的。甚至，有的肿瘤，比如肉瘤，压根就没有公认的合适的肿瘤标志物。   2：正常的细胞，有时候也会分泌这些蛋白质 也就是说，正常人，在一些特殊的情况下，比如感染、炎症、剧烈运动等情形下，部分肿瘤标志物也会升高。这就造成了一大批健康人，体检的时候，发现一个或者两个肿瘤标志物，仅仅高出一点（比如CEA正常值上限是5，某人是5.05），然后四处就医，反复检查的闹剧。   3：肿瘤标志物的检测，有时候本身波动就很大 检测血液中蛋白质的含量，是一件不太容易的技术活。因此，肿瘤标志物的检测，不同的医院，不同的仪器，不同的方法学，正常值范围可能是不一样的；相同的地方，同一份标本，连续测两次，误差也有可能是不小的。言外之意，CEA正常值是5，你才5.05，很可能只是测量误差！   综上所述，萝卜对肿瘤标志物的建议是：数值仅供参考，动态变化更有意义，疗效评价的金标准还是影像学。   PET：远非万能，合理使用 常规的影像学，如B超、CT、MRI等，只能看到肿瘤的大小、形状、位置等，但不知道肿瘤到底是死是活以及肿瘤的生长繁殖能力如何。 这就给一部分患者造成了困扰，比如做了介入栓塞、射频消融的病友，2个月后复查，肿瘤几乎还是那么大，之前的治疗到底疗效如何？此外，一部分患者特别焦虑，肺部发现了癌症，那么到底其他部位有没有？接受PD-1抗体等免疫治疗的病人，如何判断是否存在假进展？ PET通过同位素标记葡萄糖，癌细胞要是活着，而且还在活蹦乱跳、生儿育女的话，它就一定需要消耗很多的能量，需要吃进去很多葡萄糖，从而会被标记上同位素。 PET就是通过观察和计算，一定时间里身体某个部位摄取带有同位素标记的葡萄糖的多少，来反应这个部位是不是癌变了，如果是的话，肿瘤的活性如何。 这么好的东西，那是不是人人都应该做一个，是不是应该每个月都做一个？且慢，PET的确是挺好，但有三个弊端： 贵。普通的CT/MRI，一般千把块钱就搞定了，PET动辄上万。 有辐射。PET-CT的辐射，大约是CT的4-5倍；辐射，是会致癌的。 有的肿瘤，PET也是会漏掉的。比如消化道里较小的肿瘤，PET有可能漏诊。 综上所述，对于PET，萝卜医生的建议是：不建议作为癌症的早期筛查，不建议用于绝大多数肿瘤的常规随访，但是结合病情需要，该出手时还是要出手。   基因检测：这次回答五个问题 基因检测的问题，其实之前的科普文章里已经反复提及，但还是架不住病友们百折不饶地发问，因为首先推荐大家读一读这几篇之前的文章： 诊断癌症的第一天，就该知道的十件事（下） 血尿基因检测指导肺癌靶向治疗：疗效不输组织！ 【欧洲肺癌大会】癌症晚期不想穿刺活检？试一试血液检测！   1：基因检测有什么用？ 基因检测，主要的作用有如下几个： 指导靶向药选择：EGFR突变的肺癌病人用易瑞沙、特罗凯；HER2扩增的乳腺癌、胃癌病人，用赫赛汀；BRAF突变的恶性黑色素瘤患者，用维罗替尼。 指导PD-1抗体的合理使用：MSI-H或者TMB高的病人适合PD-1抗体治疗，而MDM2基因扩增等少数病人接受PD-1抗体治疗可能爆发进展。 用于疾病的复发和耐药的监测：提前几个月发现肿瘤复发、耐药：什么东西这么神？！ 筛查遗传性癌症：比如部分肠癌。 协助评估患者的生存期：比如携带BRAF突变的肠癌，相比于BRAF野生型的肠癌，生存期要短好几倍。 协助诊断一些疑难病例：比如一些形态学上非常接近的肉瘤，都需要检测特定的基因变异来确诊。   2：基因检测，测多少个基因合适？ 一般情况下，只要做国内外指南推荐的若干个基因就行了；每一种癌症，都有明确的规定和推荐，一般都在几个到十几个不等。部分无路可走或者腰缠万贯的病友，基于自愿的原则，一定要把人类已知的数百个癌症相关的基因都测一遍，那也不拦着。   3：靶向药，是不是都要先做基因检测？ 不是。抗血管生成为主的靶向药，如贝伐珠单抗、瑞戈非尼、阿帕替尼、索拉非尼、舒尼替尼、乐伐替尼、卡博替尼、西地尼布、olaratumab等新药，并不一定需要做基因检测——因为，现在并不知道，哪个或者哪几个基因突变，或者染色体改变，与这些药物的疗效有相关性。   4：血液基因检测是否靠谱？ ASCO2016 | 15000例病人：血液基因检测准确率高于90%！ […]

血液基因检测，还有一个高大上的名字——液体活检。 普通的活检，都要穿刺或者做微创的手术，一部分病人不愿意配合，而且也不能反复做。但是，血液、尿液、胸水、腹水等体液，相对而言，还是很容易获取的。因此，最近几年关于液体活检的研究，方兴未艾。 液体活检，目前做的最多的，就是循环肿瘤DNA（ctDAN）和循环肿瘤细胞（CTC），利用这两项技术，动态监测（每隔一定时间复查一次），可以用于术后复发监测、疾病耐药监测、指导靶向药选择、协助判断生存期等。 最近，国外的几大研究小组，陆续报道：基于血液循环肿瘤DNA（ctDNA）的动态监测，可以用于协助判断PD-1抑制剂的疗效。 2014年12月，美国约翰霍普金斯大学的Diaz LA Jr教授，研究了12位接受PD-1抗体或CTLA-4抗体治疗的晚期恶性黑色素瘤患者，治疗前、治疗过程中以及治疗后的ctDNA的变化。他们发现ctDNA中的基因突变浓度变化，与疾病演变相符；在一个经典病例中，ctDNA中肿瘤基因突变浓度的下降，比肿瘤缩小以及症状改善提前了很久——这位患者用药6周时，ctDNA中的肿瘤基因突变已经不可测；用药4个月后，影像学提示肿瘤明显缩小。 2017年4月，巴黎文理研究大学的F.C.Bidard教授，入组了15位接受PD-1抗体治疗的肺癌、肠癌、恶性黑色素瘤患者，治疗前测一下ctDNA水平，治疗8周后测一次ctDNA谁。他们发现：治疗8周后ctDNA浓度由原来的较高值降低到不可测的患者，对PD-1抗体疗效较好，生存期较长——下图的黄色和蓝色曲线，代表服药8周后ctDNA浓度降低到不可测的病友，7位病友，6位有效。 2017年6月，图卢兹大学医院Pradines A教授，发现对于那些接受PD-1抗体治疗后，影像学上出现肿瘤增大、出现新增肿瘤等疾病进展表现的病人，如果他们的ctDNA水平是下降的，那么有较大可能性是“假进展”。 下面这位病友就是一个典型的案例，这个病友在接受PD-1抗体治疗前，ctDNA中KRAS突变的浓度在200多，用药1个月后浓度就已经降到0了。病人2个月、4个月的时候，复查CT，肿瘤都是“增大”的，但是它的ctDNA浓度一直是0，于是他的主管医生觉得应该再给他一些机会，结果再过一段时间，肿瘤就消退下去了——一例经典的“假进展”。 而下面这位病友，则是真进展，肿瘤增大，且ctDNA中肿瘤基因突变的浓度也在增大。 CtDNA中基因突变的监测，可以用于免疫治疗疗效的早期预测，可以用于真假进展的判断，看来的确不错。当然，上述研究入组的病人都较少，尚需更大规模的临床试验进一步证实。   参考文献： [1]Lipson EJ, Velculescu VE, Pritchard TS, et al. Circulating tumor DNA analysis as a real-time method for monitoring tumor burden in melanoma patients undergoing treatment with immune checkpoint blockade. J Immunother Cancer. 2014 Dec 16;2(1):42 [2]Cabel L, Riva F, Servois […]

如今的医学，诊断肿瘤方法除已有的影像学、肿瘤标志物等传统方式，基于血液标本的循环肿瘤细胞（CTC）、循环肿瘤DNA（ctDNA）是研究的热点。   20世纪中期，人们研究发现，细胞核内DNA并非一直隐藏在细胞核内，他们会到处溜达，游离在血液等体液中的DNA称为cfDNA。循环肿瘤DNA（ctDNA），顾名思义，就是肿瘤细胞来源的cfDNA，主要存在血液、滑膜液、脑脊液、尿液等。   作为cfDNA中特殊类型，ctDNA能够直接反映肿瘤患者的基因信息。相比于其他传统的肿瘤标记物，ctDNA有半衰期短、假阳性率低、实时反映肿瘤本身特点。但是ctDNA本身含量少，提取检测难度大。随着定量检测技术发展，DNA检测灵敏度逐渐提升，人们陆陆续续在多种肿瘤类型患者中研究，证明ctDNA在肿瘤诊断和治疗中的价值。 利用ctDNA中的基因突变，进行肿瘤的动态监测，可以更早地发现疾病复发或者靶向药耐药：这方面，咚咚肿瘤科已经发表了不少的科普文章☞提前几个月发现肿瘤复发、耐药：什么东西这么神？！   最近的2017年美国临床肿瘤学年会报道了一项有趣的研究：利用ctDNA监测，也可以预测免疫治疗的疗效。科学家发现，在使用PD-L1抗体durvalumab药物治疗的尿路上皮膀胱癌患者中，ctDNA水平降低的患者有更长的无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）。   截止2016年10月24日，共入组103位尿路上皮膀胱癌患者。他们每2周接受10 mg/kg durvalumab药物治疗，平均随诊8.4月。共测量33位膀胱癌患者治疗前和29位患者治疗前和6周治疗后的血浆ctDNA，检测70个肿瘤基因有无突变，并统计患者治疗前6周的平均等位基因突变频率（VAF，包括单核苷酸突变，基因插入或缺失）。   结果：使用durvalumab治疗6周后，缓解组患者ctDNA中平均VAF显著下降，而复发组患者ctDNA中平均VAF下降则不明显。ctDNA VAF下降组患者和VAF升高组患者的无病生存期和总生存期见下表。 VAF下降/升高的患者生存情况对比   结论：①durvalumab治疗6周后，对药物有反应的患者ctDNA VAF减少，复发患者ctDNA降低无统计学意义。②durvalumab治疗6周后，VAF下降的程度和患者的无病生存期和总生存期相关，提示VAF可以作为临床有效监测病情有无复发或缓解的预测因素。 总的来说，ctDNA对于肿瘤的早期诊断、个体化治疗、监测病情、早期发现疾病复发都有重大意义，近些年来人们致力于如何有效利用该标志物帮助癌症诊断和监测。除了上文提到的膀胱癌，在乳腺癌、结肠癌、肺癌等肿瘤领域也有类似研究，并得到相似的结论。我们可以期待该技术日趋完善成熟后将会给肿瘤诊断和治疗带来重大的帮助。 参考文献： [1]http://abstract.asco.org/199/AbstView_199_184983.html [2]Wan JC, Massie C, Garcia-Corbacho J, et al. Liquid biopsies come of age: towards implementation of circulating tumour DNA. Nat Rev Cancer. 2017 Apr;17(4):223-238.

经常有病友问：血液基因检测，到底是否靠谱？——这个问题其实不好回答，关键是血液基因检测的方法太多，检测的东西也不一样，答案是不一样的。 如果用数字PCR的方法，检测少量的、若干个（比如1个，2个这样）已经很成熟的基因突变，比如肺癌病友的EGFR L858R突变、EGFR T790M突变、EGFR 19外显子缺失突变之类的，那么阳性率和准确率，大约能高达95%以上，而且目前已经获得国内外相关部门的许可，绝大多数专家也是认可的。 ↑↑↑目前咚咚EGFR单基因检测都是ddPCR（微滴式数字PCR）平台检测，更加精准。 但是，如果用二代测序的方法，同时测试几百甚至上千个基因，那么其靠谱程度，目前还是一个未知数。 今年的美国临床肿瘤学年会正在芝加哥召开，会上公布了一个大数据：入组了161名患者，同时收集血液和组织标本，进行508个基因的二代测序分析。 89%的病人，在血液中也能测到至少1个基因突变，也就是阳性率大约是89%；乳腺癌患者，97%的病人血液中能测到至少1个基因突变；非小细胞肺癌的病人，85%，前列腺癌的病人，84%——总体而言，阳性率还是蛮高的，逼近90%。 准确率如何呢？那就要看病理组织中检测到的突变，和血液中检测到的突变，是不是一样。 组织中检测到的突变，73%能在血液中同时检测到；对于那些有靶向药可用的、对于病人的治疗意义重大的“幸运突变”，76%能同时从血液中测到。 此外，也发现一个有趣的现象： 一小部分病人，在血液中测到了有药可用的“幸运突变”（如ESR1, PIK3CA, HER2, EGFR等），但在组织中没有测到。也就是说，有时候血液检测比组织检测发现了更多的“幸运突变”。当然目前尚不可知这些突变是不是有意义，病人根据血液检测的结果指导靶向药治疗，疗效几何。 综上所述，截止到目前，利用血液标本、用二代测序的方法，进行大规模的基因检测，阳性率还是不错的，准确度大约在70%-80%；更新、更准确的技术，还有待进一步改进和创新。 参考文献： [1]http://abstract.asco.org/199/AbstView_199_191692.html [2]http://www.onclive.com/conference-coverage/asco-2017/novel-sequencing-approach-detects-circulating-tumor-dna-in-89-of-patients-with-advanced-cancer

一年一度的美国临床肿瘤学年会 (ASCO)，正在芝加哥如火如荼地召开，来自全世界数万名肿瘤学顶尖专家正在你追我赶地宣布自己的重大发现。 法国里昂的一群科学家宣布了一个精准医学的重磅突破：2490名复发难治、其他治疗均告失败的病友参与了一项名为ProfilER的基因检测指导下的靶向治疗研究。他们发现：52%的病友至少有1种靶向药可用，部分听从基因分析的结果接受了靶向治疗的病友生存期明显延长。 这是一项颠覆性的研究，开放入组，不区分癌种，只要是复发难治、现阶段“无药可医”的病友，拿着病理组织，自愿接受基因分析。 ↑↑↑不同癌种，相同基因的患者被分进同一个篮子里 截止到目前，他们已经入组了2490名患者，已经完成了1826份病理组织的基因分析：60个最常见基因的分析和外基因组分析——940名（52%）患者至少有一种可以有靶向药可以用的基因突变（579名患者只有1种“幸运突变”，另外的358名患者至少有2种”幸运突变“，最多的患者有6种”幸运突变“）。 最常见的“幸运突变“包括： KRAS (n=156, 8.5%)，PIK3CA (n=150, 8.2%)，CDKN2A (n=174, 9.5%)，PTEN (n=49, 2.7%)，CCND1 (n=97, 5.3%)，FGFR1 (n=56, 3.1%)，MDM2 (n=53, 2.9%)，HER2 (n=42, 2.3%)，EGFR(n=41, 2.2%)。 根据这些基因突变，就可以针对性给病友推荐合适的靶向药了，专家组一共给644名患者基于基因分析推荐了合适的靶向药，其中101名患者接受了专家组的建议（另外的五百多人，由于各方面的原因，比如经济能力、比如患者主观意愿等，未听从专家组的建议接受相应的靶向治疗）。 专家组给出的靶向药，最常见的是mTOR抑制剂、抗血管生成药物、EGFR抑制剂、细胞周期调控的靶向药等。 疗效方面： 2.3%的患者完全缓解、15.1%部分缓解、33.7%疾病稳定——总的疾病控制率51.1%，24%的患者疗效维持时间超过半年。 更重要的是，与未接受专家组的建议的病友相比，接受了相应的靶向治疗的病友，生存期明显延长。两组的3年生存率分别是46.1% VS 53.7%, 5年生存率分别是28.1% VS 34.8%，绝对数提高了7%，相对数提高了24%——接受基于基因分析结果推荐的靶向治疗的病友，死亡风险降低了24%！ 目前该临床研究还在继续进行，期待传来更多的佳音。 参考文献： [1]http://abstract.asco.org/199/AbstView_199_191877.html [2]http://www.onclive.com/conference-coverage/asco-2017/genomic-profiling-yields-os-benefit-for-patients-with-targeted-therapy-matches

清华大学罗永章教授的“滴血测癌”之所以引起社会的广泛关注，是因为它让很多人看到了能把癌症扼杀在萌芽阶段的希望。 除了常见的肺癌肿瘤标记物CEA、NSE、SCC、TPS等可以用于癌症的早期筛查（这些其实并不怎么靠谱），我们还有无须大动干戈、开膛破肚、温柔一点的备选方案吗？ 循环肿瘤DNA(Circulating tumor DNA, ctDNA)或许就是这突破口。ctDNA是指从肿瘤或循环肿瘤细胞，释放到体液循环系统中的游离DNA片段。ctDNA的释放机制目前尚未完全明确，研究表明，血液中的ctDNA是肿瘤本身细胞的凋亡、坏死或循环肿瘤细胞裂解等机制所造成DNA漏出和释放的结果。 研究表明，肿瘤患者血浆中的ctDNA高于正常人，ctDNA的高低与肿瘤转移、分期、以及患者的预后均有关联。对于早期癌症患者，血浆中的ctDNA有望成为检测其基因突变类型的另一方式。北京大学人民医院胸外科陈克终等人2015年对比了58名非小细胞肺癌早期患者（IA/IB/IIA）肿瘤DNA和血浆ctDNA中50个癌症相关的基因突变情况。 在这58名患者中，有45名患者(77.6%)存在基因突变，分别在肿瘤DNA和血浆ctDNA中检测到59和76个基因突变，其中34个在两者中均有检出，两种检测方法的一致率为50.4%。主要突变类型为EGFR，KRAS，PIK3CA和TP53。此外，该研究还比较了血浆中的五种肿瘤标记物和ctDNA，肿瘤标记物和ctDNA检出率分别为43.1%和89.7%，对于早期非小细胞肺癌患者来说，血浆中ctDNA的检测率明显高于目前常见的肿瘤标记物。 北京301医院研究了41例非小细胞肺癌患者手术前后ctDNA风度，检测到30例早期（Ⅰ-Ⅱ期）非小细胞肺癌患者血浆ctDNA的常见驱动突变，并且与组织tDNA高度一致，一致性为80%，敏感性75%，特异性90%。手术后有91.7%的突变出现了突变丰度的显著下降，验证了ctDNA丰度可以作为手术监测指标，并且有极高的敏感性。另外，ctDNA与6个肿瘤标志物（CA125、CA19-9、CYFRA21-1、CEA、NSE和SCC）阳性检出率对比结果显示，ctDNA比上述6种常见肿瘤标志物具有更高的检出率。 以上两个研究结果均显示：对于非小细胞肺癌，特别是早期的患者，ctDNA比目前的其他肿瘤标志物具有更高的检出率，且更敏感。 检测ctDNA可以实时反映肿瘤发生、发展或治疗过程中的信息。与传统的组织活检相比，具有取材方便、无创、患者依从性好等优点。ctDNA也可能成为基因突变检测的替代方法，在陈克终团队的研究中，血浆ctDNA中检测到了比肿瘤组织更多的突变基因。此外，ctDNA也可以用于检测肺癌患者对靶向药物耐药的情况，实时监测靶点是否发生耐药突变，以指导后续治疗方案的制订。 总而言之，ctDNA检测在早期肺癌辅助诊断、突变基因检测、靶向药物耐药检测、以及评价干预治疗的疗效等方面前景广阔，但要真正实现其在临床上的应用，很多问题还需进一步研究。 参考文献 [1]Chen K.Z., Lou F., Yang F., et al. Circulating tumor DNA detection in Early-stage non-small cell lung cancer patients by targeted sequencing. Scientific Reports. 2016. [2]Guo N.N., Lou F., Ma Y.F. et al. Circulating Tumor DNA Detection in Lung Cancer Patients before […]

海普洛斯推出【液体活检口袋书】专栏，对液体活检进行系统、全面的介绍。 第8期，我们将对cfDNA全基因组测序技术进行介绍，期望使您熟悉该领域的发展情况。 ▼ cfDNA全基因组测序技术的魅与惑 从无创产检到肿瘤检测 科学研究的一大魅力之处在于，当探究一个问题时，总会伴随有其他的意外发现，同时也有新的问题产生。自然乐于馈赠，亦彰显神秘。cfDNA全基因组测序技术的发展为此做了一个很好的例证。该技术始于无创产前诊断，可以灵敏地检测出妊娠期胎儿染色体倍性异常；然后缘于意外地在无创产前诊断中发现，假阳性结果可能是母体患肿瘤所致，进一步应用到肿瘤诊断领域；再接着通过技术不断改进，又广泛应用于肿瘤研究各个领域，包括驱动变异寻找，耐药机制探究和肿瘤早筛等。 无创产前检测中意外诊断出了肿瘤 液体活检第一个走向临床的产品是无创产前诊断，其原理是：在妊娠期，胎儿的游离DNA片段会穿过胎盘释放到母体外周血中，其在母体cfDNA中的比例约为5%-20%。应用大规模平行测序技术对母体cfDNA进行测序，将比对到各染色体的reads数通过均一化后，可代表每条染色体的数量。含有三条21，18或13号染色体的异常胎儿会释放更多特定染色体的cfDNA到母体血浆中，导致该染色体的reads数比例增加。[1] 一位37岁的母亲，在妊娠第十三周进行了无创产前检测，结果显示13号染色体为三倍体和18号染色体为单倍体的染色体倍性异常。进一步的羊膜穿刺手术却显示胎儿染色体倍性正常。为了排除无创产前技术操作过程中的问题，该孕妇在妊娠第十七周进行了第二次无创产前检测，结果仍显示13号和18号染色体倍性异常。在产后该母亲出现了明显的子宫颈癌症状，并诊断出了子宫颈癌。肿瘤组织检测发现肿瘤细胞染色体倍性异常。真相终于大白：原来异常的无创产前结果是由于母亲患肿瘤所致，那些异常的cfDNA不是来自胎儿，而是由母体肿瘤释放的。[2] 这不是个例，在美国一项针对无创产前假阳性结果的研究中，12.5万的检测样本中，3700多例结果为阳性，其中39例出现多条染色体倍性异常， 这其中的10人进一步被诊断出患有肿瘤，并且她们生下的胎儿都是正常的。因此，当无创产前的检测结果和进一步的羊水穿刺结果不一致时，母亲约有20%-44%的风险患有肿瘤。[3] 技术更新带来肿瘤领域的广泛应用 而上面的问题更容易让我们深入思考，是否我们可以用无创产前技术来做肿瘤诊断？大量的肿瘤基因组测序结果表明，肿瘤基因组总会有染色体结构变异，甚至某些基因组区域的拷贝数变异和融合是肿瘤的驱动突变，在肿瘤的发生和进化过程中起到了关键作用。是否我们可以利用该技术来检测肿瘤患者基因组染色体结构变异，以此来做肿瘤诊断？ 在一项应用无创产前技术对16例早期和16例晚期卵巢癌患者进行检测的研究中，分别占6/16和7/16的早期和晚期患者中检测到了>15M染色体区域的倍性异常。[4] 这个结果差强人意，但这其实只是无创产前技术上的限制，无创产前技术的cfDNA全基因组测序深度仅有0.1X-0.2X，同时由于CNV算法上的原因，其能检测到染色体倍性改变的区域仅限于大于15M的大区域。如果我们增加测序深度，并改进算法，相信可以检测到小区域内的染色体倍性区域改变，而这些染色体小区域的改变在肿瘤基因组中更常见。果然在另一项研究中，研究者在加大了测序深度，并改进了基因组拷贝数变异算法后，可以检测到小于5M区域的染色体结构变异，在肿瘤患者中检测到亚染色体区域异常的灵敏度达到了29/31。[5] 在目前测序成本较高的情况下，进行高深度的cfDNA全基因组测序并不现实，于是发展出了新的折中模式：低深度全基因组测序+高深度区域靶向测序。低深度全基因组测序可以检测出大区域的染色体结构变异，为了进一步深入研究小区域内的基因组拷贝数变异，可以进行区域靶向高深度测序。这样便可以较全面有针对性的检测出肿瘤染色体结构变异。该技术很快便广泛应用于与肿瘤拷贝数变异相关的驱动变异寻找，治疗检测和耐药机制探究等领域。[6-8] 在肿瘤早筛中的机遇与挑战 在肿瘤研究领域，肿瘤早筛是目前难以跨越的高峰。因为在肿瘤发生早期，癌变的细胞数目非常有限，常规的影像学和蛋白分子标记等检测手段无能为力。来自于受检者外周血中的cfDNA，可以动态全面的反映受检者基因组状况，因此是绝佳的肿瘤早筛研究对象。早期肿瘤细胞释放到血液中的ctDNA量同样非常有限，其在cfDNA中的含量一般在万分之一以下，因此想检测到ctDNA中SNV和INDEL水平上的变异，对于目前的DNA检测技术来讲，非常具有挑战性。但是我们可以利用cfDNA全基因组测序技术，检测其是否有染色体结构异常，即便是万分之一以下的变异，技术上也是可行的。 然而，利用该技术进行肿瘤早筛，仍然困难重重：首先，我们需要获得健康人的cfDNA染色体倍性基线，cfDNA有独特的断裂方式，释放到血浆中的cfDNA并不是均匀覆盖基因组，因此健康人基线对于灵敏检测非常关键。其次，要想获得合理的测序深度和染色体结构变异算法，需要不断的技术优化。最后，能否检测到特异的染色体结构变异，以此作为肿瘤早筛的分子标记，尚需要事实来说话。 -END- Reference [1]PrasadV., Non-invasive, serum DNA pregnancy testing leading to incidental discoveryof cancer: A good thing?,Eur J Cancer (2015),http://dx.doi.org/10.1016/j.ejca.2015.07.029 [2]OsborneCM, Hardisty E, Devers P, et al. Discordant noninvasive prenatal testingresults in a patient subsequently diagnosed with […]

海普洛斯推出【液体活检口袋书】专栏，对液体活检进行系统、全面的介绍。 ▼ ctDNA检测技术 针对ctDNA中的超低频突变，海普洛斯基于单分子编码原理开发了CUBE-ctDNA专利技术。该技术通过优化测序文库的制备过程，采用三步法：制备、连接、富集，完成对ctDNA的单分子编码标记，有效地过滤二代测序PCR错误及测序错误，结合10000X测序深度，可提高检测灵敏度至0.05%。 另外，常规的开源分析软件对于超低频突变的检出准确性差，因此，海普洛斯针对ctDNA的测序数据分析建立了全新的软件体系，并且将其中很多一部分，以项目名OpenGene（详情见：https://github.com/OpenGene）进行了开源，包括：AfterQC数据过滤和质控、SeqMaker测序数据模拟、MutScan突变扫描和可视化、MrBam测序数据的重复性分析、CfdnaPattern血浆循环DNA的模式识别、FusionDirect融合基因的检出、DeepSomatic基于深度学习的遗传/体细胞突变分类等。这充分显示了海普洛斯在ctDNA检测分析上的实力，也展示了海普洛斯的精神，那就是：开创，开放，开源！ 结合测序技术和分析能力，我们进行ctDNA检测的敏感性大大提高。通过155例样本的测试（其中组织EGFR阳性63例，阴性92例），ctDNA检测敏感性达90.5%，特异性达到98.9%。 肺癌ctDNA检测 EGFR阴性检出率 EGFR阳性检出率 ctDNA与肿瘤组织一致性 98.9% 90.5% 95.48% 表：海普洛斯肺癌ctDNA检测数据   万人癌症基因组计划 万人癌症基因测序计划，是中国首个大型癌症“精准医疗”计划。该计划由深圳市海普洛斯生物科技有限公司携手深圳市人民医院联合启动。该计划针对肺癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、肝癌等五种中国人群高发癌症，旨在实现10，000人的癌症早期筛查、预后监测、个体化用药指导，建立中国首个大型癌症基因数据库，为实现精准医疗奠定基础。 海普洛斯通过该计划，已收集数千例ctDNA样本，利用这些数据建立基线，区分正常人即会携带的cfDNA突变与肿瘤特异ctDNA突变，能够帮助我们进一步过滤假阳性突变，获得更高的检测准确率。 图：海普洛斯的数据积累   ctDNA与用药指导 海普洛斯基于CUBE-ctDNA技术，开发了一系列ctDNA检测指导肿瘤用药的产品，这一系列称为海普安可(HapOnco™)，主要用于肺癌、结直肠癌、乳腺癌等实体肿瘤靶向药物的用药指导。 海普洛斯也在积极更新和开发新产品，比如针对免疫治疗的用药指导。免疫检查点抑制剂已经在多种肿瘤中显示良好的疗效，但如何筛选适用人群仍然没有定论，其中突变负荷可能是很重要的一个指标。我们正在积极开发基于ctDNA的突变负荷检测产品，这正是基于专用的软件和大量数据建立的基线，能够更准确地识别出ctDNA中的变异。 ctDNA与肺癌早期诊断 在低剂量螺旋计算机断层扫描（low-dose computed tomography, LDCT）肺癌筛查中会发现大量的结节。目前对于肺结节的良恶性判断主要包括临床和影像学判断。临床评估，包括年龄、性别、职业、吸烟史、费病史和家族史等。 然而在临床应用中，大多数结节是由感染、炎症所形成，为良性结节。在美国国家肺癌筛查试验中，CT筛查组中96.4%的阳性结节为良性。根据统计显示，应用LDCT筛查肺结节直径在5-10mm的患者肺癌发生率为0.9%～5.8%，直径>10mm患者肺癌发生率为11.1%～26.2%。对于LDCT应用于肺癌筛查的假阳性患者，特别是直径<10mm肺结节患者，会导致过度诊断和治疗及增加受检者焦虑。 利用ctDNA检测中癌基因、抑癌基因的突变信息，可以辅助肺结节良恶性的诊断。海普洛斯通过对这些突变构建模型，结合影像学结果进行分析，前期预试验准确率达到74%。目前模型仍在不断优化中，而更大规模的全国多中心临床试验也即将开始。 以上介绍的只是海普洛斯工作中的一部分，我们还会积极创新开发出更多新技术和产品，为肿瘤的预防与治疗提供技术手段，让每一个生命健康120年！ -END-   往期回顾 【液体活检口袋书第6期】ctDNA的四大应用 【液体活检口袋书第5期】ctDNA检测的终极武器 【液体活检口袋书第4期】从孟德尔的发现到NCCN指南：ctDNA的成长之路 【液体活检口袋书第3期】液态活检三大标志物介绍 【液体活检口袋书第2期】它绝非仅是组织活检的替代品 【液体活检口袋书第1期】液体活检是什么？靠谱吗？有前途吗？ 参考文献 1.Chen S, Han Y, Guo L, Hu J, Gu J, SeqMaker: A Next Generation Sequencing […]

海普洛斯推出【液体活检口袋书】专栏，对液体活检进行系统、全面的介绍。 第6期，我们将对ctDNA的应用进行介绍，期望使您掌握目前ctDNA在各方面应用的理论基础和进展情况。 ▼ ctDNA的应用 ctDNA检测由于实时、无创、灵活等特点，可以应用于肿瘤的各阶段，解决不同的问题，从早期筛查、辅助诊断、预后判断、到靶向用药指导、疗效及耐药监测等。 由于ctDNA含量与肿瘤负荷、肿瘤分期、转移等密切相关，所以目前晚期肿瘤的用药及监测等应用相对更加成熟；而对于早期肿瘤的筛查与诊断，技术上难度更高，整体上仍处于科研阶段。 图：ctDNA含量在转移癌和原位癌、不同分期间的差异。   靶向用药指导 在靶向用药指导上，可以说ctDNA已经确立了江湖地位了。一方面，样本易获取，在组织样本无法获得时可以作为替代品；而另一方面，ctDNA的全面性也可以避免很多肿瘤异质性带来的假阳性。 以Guardant Health的数据为例，我们可以看出，组织和血液互为参照的话，假阳性率都很低，但都存在一定假阴性，血液的敏感性甚至高于组织！也就是说，血液检测的结果绝不只是组织的替代品，而是一个有效的补充。如果血液和组织同时检测，能够进一步提高检出率，使更多患者受益。 图：cfDNA与组织检测同时进行，可使诊断准确率上升。 另外，组织和血液的阳性结果，对于用药来说，意义是等同的。例如，在AZD9291的临床试验中，组织和血液阳性样本对药物的反应率一致，单样本阳性和双样本阳性的患者生存获益没有差异。 图：左为组织，右为血液。   动态监测 ctDNA中肿瘤相关的突变频率，会随着肿瘤的进展和治疗而动态变化，因此监测这些突变频率的变化过程，可以指示治疗的疗效、耐药以及肿瘤复发等。 早在2008年，Diehl F.等就发现，APC、KRAS、TP53、PIK3CA等基因热点突变的频率会随着治疗过程变化，变化趋势与肿瘤负荷呈正相关。 图：ctDNA可以作为动态监测的工具。 同样，ctDNA突变频率的变化也可以指示复发，例如Reinert T.等人通过ctDNA的监测与CT和蛋白标志物的对比，发现在部分病例中，ctDNA频率的升高，要早于影像学和蛋白标志物的变化，以便于尽快采取治疗措施。 图：ctDNA是更为灵敏的蛋白标志物。   预后判断 术后ctDNA的检出情况可以提示预后，利用ctDNA特征突变是否检出、突变频率值或术前术后突变频率的变化，均可以作为预后的判断指标。 图：利用ctDNA是否检出对复发风险的判断要优于CEA。 图：ctDNA突变频率与生存率负相关。   早期筛查与诊断 由于ctDNA释放较少，肿瘤早期的筛查与诊断的难度更高。另外，肿瘤的个体差异导致，难以用少数几个基因状态来衡量所有人，必须需要上百甚至上千个肿瘤相关基因，来建立一个复杂的模型，通过对突变、甲基化等情况的分析来综合考量。 目前，尚没有见到前瞻性研究的成果，不过，已有一些回顾性的研究预示着这种应用的可行性。海普洛斯通过数十例的前期样本，通过ctDNA上百个基因突变的模型，判断肺结节良恶性，并区分病理类型，达到了70%以上的敏感性和特异性；另外，ctDNA甲基化也可用来进行肿瘤诊断和组织溯源。例如，卢煜明教授团队发现，利用ctDNA低甲基化来判断肝癌，可以达到74%的敏感性和94%的特异性；2015年，他们又发文章表示，ctDNA甲基化模式可以区分组织来源。 相信随着研究规模的扩大，大数据与机器学习等手段的运用，利用ctDNA进行肿瘤筛查和诊断也将逐渐成为可能！ -END- 往期回顾 【液体活检口袋书第5期】ctDNA检测的终极武器 【液体活检口袋书第4期】从孟德尔的发现到NCCN指南：ctDNA的成长之路 【液体活检口袋书第3期】液态活检三大标志物介绍 【液体活检口袋书第2期】它绝非仅是组织活检的替代品 【液体活检口袋书第1期】液体活检是什么？靠谱吗？有前途吗？ 参考文献 1.Bettegowda C, et al. Detection of Circulating Tumor DNA in Early- and Late-Stage Human […]

作者：芒果 大家还记得3月21日咚咚推出的重磅福利吗？价值¥18600元的基因检测免费送！活动一经发布，便得到了广大咚友们的积极参与和支持。至今天（3月28日）中午12:00，由新浪微博官方唯一抽奖平台监督并抽奖，快来看看幸运之星是不是你～ 为确保该获奖者满足活动参与要求，我们立即与该获奖者微博沟通，邀请TA及时提交咚咚肿瘤科APP 截图及病历截图，如24小时内未收到回复，我们将重新抽取！经审核，该获奖者符合相关要求，再次恭喜TA！ 在此我们也十分感谢广大咚友们一直以来的大力支持，类似这样的好的福利，我们也将会继续为大家争取更多！咚咚一直走在为肿瘤患者及家属服务的路上，无论是国际最新药物资讯、医生问诊、基因检测及港澳预约等等，我们都将不遗余力，做到更好！ 【特别提示】其他没有抽中免费检测的咚友们，咚咚也想尽力帮助大家。如近期也有检测需求的咚友们，可以及时与我们取得联系，我们将为大家争取团购550基因的优惠价（截止到31日），人数越多，优惠越大，有兴趣的赶紧咨询客服！再次感谢咚友们的支持！

海普洛斯推出【液体活检口袋书】专栏，对液体活检进行系统、全面的介绍。 第5期，我们将对ctDNA的关键技术细节进行介绍，期望使您深刻理解ctDNA在液体活检中占据重要地位的原因。 ▼ ctDNA中的肿瘤信息就像是宝藏吸引着科学家们的眼光，然而要想探索宝藏，首先要得到绝世神兵，今天就给大家介绍下这把终极武器的妙用吧！ ctDNA检测 为什么需要更高灵敏度的技术？ ctDNA的检测，相比于组织活检，有更高的灵敏度要求。这其中最重要的原因，就是我们目前没有办法单独获取来自于肿瘤的游离DNA！所谓ctDNA检测，是检测所有cfDNA后分析肿瘤特异性的变异，并将携带这些变异的DNA片段视作ctDNA。 图：从一堆游离DNA中挑出来自肿瘤的游离DNA，可不是一件容易的事儿。 然而，机体的肿瘤细胞相比于正常细胞的数量，简直是九牛一毛。当然这也跟肿瘤的大小、分期、转移等是相关的，不同患者间ctDNA占cfDNA的比例变化范围很大，可从0.01%-90%，大多在千分之几的级别。所以，ctDNA的突变频率明显低于组织活检，有研究表明，有半数以上的突变频率低于0.4%！ 图：半数以上的突变频率低于0.4%。突变如此低频，技术须更灵敏。   常用检测技术为什么难以满足需求？ 目前常用的ctDNA检测技术主要有以下几种： 技术 适用性 灵敏度 ARMS-qPCR 组织突变检测 1% NGS 多基因扫描 1% dPCR 位点监测 0.01% BEAMing 位点监测 0.01% ARMS-qPCR操作简便，且有成熟试剂盒。NGS的检测范围广，能同时检测突变、扩增、融合。然而这两种技术都存在灵敏度低的问题，特别是NGS，更需要降低背景噪音的技术。 dPCR和BEAMing的灵敏度足够高，但两者都存在检测位点数目少的局限性，因而不适合用于用药指导。 ARMS-qPCR (Amplification Refractory Mutation System)方法是临床上常用的组织活检突变检测方法，简便易行，大多数医院都可以自行操作。然而在液体活检中，这1%的灵敏度可就不够看了，会导致大量假阴性的出现。《非小细胞肺癌(NSCLC)血液EGFR基因突变检测中国专家共识》中提到，与肿瘤组织相比，基于ARMS方法的ctDNA检测敏感性相对较低，在IPASS、IFUM和IGNITE三项研究中分别为43. 1%、65. 7%和49. 6%，这种敏感性显然是不能满足需求的！ dPCR（digital PCR）和BEAMing的检测方式类似，通过将反应体系细分来提高灵敏度。我们可以理解成一个集成的qPCR反应，将反应体系分成成千上万个，每个反应中含有一个模板DNA分子，通过识别阳性反应数来实现模板分子的绝对定量。反应体系越多，能达到的灵敏度就越高。这两种方法的优势自然是灵敏度，高达0.01%甚至0.001%。然而，我们也能看出，灵敏度跟模板分子数量相关，所以对样本量要求较大，10ml血液往往仅能检测有限几个位点。目前，主要应用在于特定位点的疗效跟踪和耐药监测，对于用药指导、早期辅助诊断等则不适用。 NGS由于存在大量背景噪音，会淹没频率在1%以下的突变，也因此限制了测序的准确度。也就是说，普通的NGS用于ctDNA检测，其结果将会与ARMS-qPCR半斤八两，但为什么NGS技术在ctDNA研究中反而应用越来越广泛呢？这就要归功于今天的主角——分子标签技术了！ 分子标签技术是什么？ 它是如何提高NGS检测灵敏度的？ 要理解分子标签技术的作用，首先要理解NGS的背景噪音来源。NGS有另外一个名字，叫深度测序，也就是说，对于一个位点，需要很多个DNA片段覆盖它，才能够进行准确分析。在这过程中，需要经过模板的PCR扩增，而DNA聚合酶可能会连接上一个错误的碱基，导致错误；另外，测序系统最后的信号识别也会发生错误。当然，常规情况下，我们不知道这些是真突变还是系统错误，而系统错误又极多，所以只能根据突变频率将背景噪音全部过滤，同时低频的真突变也会被殃及，这就是为什么背景噪音是限制灵敏度的原因了。 2012年5月，Forshew T等人率先发表文章，开发了基于分子标签的TAm-Seq方法。2012年9月，Michael W等人也发表文章，利用双链分子标签，将错误率显著降低，其中双链匹配的数据中，错误率可降低至∼0.001% mutations/bp！当然，实际应用中很难达到这么高，但也足够将灵敏度提高到0.1%以上了。 分子标签技术是在DNA模板上连接一段随机序列，相当于给每一个DNA模板加上一个独特的分子标签，从而可区分不同来源的模板。这样在进行数据分析时，可以根据标签序列识别同一DNA模板扩增出的片段，把它们统一分析，从而过滤掉PCR错误及测序错误，提高检测灵敏度和准确性。 图：双链分子标签原理图。 如图中显示的就是双链分子标签的分析原理，α和β就是一段随机的DNA序列，不同的DNA模板连接的α和β是不一样的。我们可以通过α和β序列来识别同一模板来源的片段，同时根据α和β互补识别同一模板来源的正反义链（单链分子标签相当于只有α，就无法实现这个功能了）。 左侧显示的是一个PCR扩增后期引入的错误或一个测序错误，仅影响少数DNA序列，由于同一模板来源的片段理应序列相同，因此利用少数服从多数的原则就可以过滤掉；中间部分显示的是一个PCR扩增早期引入的错误，影响了正链所有序列，但反链无突变，而碱基互补是DNA双链的基本原则，因此这种错误也可以得到校正（仅双链分子标签可以实现）。 通过分子标签技术，可以大幅降低NGS的背景噪音，从而提高测序准确度，显然双链标签比单链标签的过滤能力更强！然而，虽然原理上容易理解，科研上也逐渐得到广泛应用，但实现应用起来却存在接头连接效率低、双链互补数据比例少等问题，需要不断优化，还要开发配套的信息分析系统。因此能够实现其应用的公司就寥寥可数了！这些公司的NGS液体活检技术会有所差别，但背景噪音过滤的原理都基于分子标签。 海普洛斯通过不断优化，开发出专利的CUBE-ctDNA测序技术，基于双链分子标签的原理，将检测灵敏度提高至0.05%。 基于分子标签技术的NGS技术，集合了检测范围广和高灵敏度的优势，在肿瘤用药指导、早期诊断、早期筛查、预后判断、耐药机制分析等方面，势必会得到越来越广泛的应用！后面的文章会陆续介绍给大家。 最后要吐一个槽：一切脱离技术原理吹嘘灵敏度的行为都是耍流氓！ […]

海普洛斯推出【液体活检口袋书】专栏，对液体活检进行系统、全面的介绍。 第3期，我们将对液体活检的三大标志物进行介绍，期望使您掌握液体活检三大标志物各自的优势、不足及应用范围。 ▼ 图：液体活检三大标志物。 肿瘤液体活检是一个广义的范畴，目前主要是利用血液中的标志物来反映肿瘤的特定信息。这些标志物主要包括CTC、ctDNA、外泌体（exosome）,今天我们就来简要介绍这三种标志物。 CTC：一整个肿瘤细胞 循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell, CTC），是指从实体瘤中脱离出来并进入外周血液循环的肿瘤细胞。1869年，澳大利亚学者Ashworth在一例转移性肿瘤患者血液中首次观察到从实体肿瘤中脱离并进入血液循环的肿瘤细胞，并率先提出了CTC的概念。 CTC数目往往很少，而血液中血细胞的数量则非常庞大（1ml血液中白细胞400-1000万个），要想检测CTC，关键在于根据CTC的物理学特征（大小、密度、电荷、可变形性）和生物学特征（表面抗原、侵袭性等），来实现CTC从血液中的识别和富集。 根据CTC往往比血细胞要大个点儿来识别显然不那么靠谱，然而利用抗原来识别也面临很多问题，需要预先知道要寻找的细胞的特异抗原，而且并非所有CTC都有着相同的抗原特征。如果设定的抗原特异性稍差，哪怕是99.99%的特异度，也会导致成百上千个白细胞掺入；而根据特定抗原来识别CTC的敏感性也是不容乐观，可能会错过大量不含有该抗原的CTC。 目前FDA和CFDA有批准的CTC检测产品，均是根据肿瘤细胞特定抗原对CTC进行计数，利用血液中CTC数目提示疗效、预后等信息。而CTC的富集和后续分析，目前还很少有应用，一是技术难度大，更重要的是少数几个CTC很难完整反映肿瘤完整的信息。 ctDNA：带有肿瘤信息的DNA片段 循环肿瘤DNA（Circulating tumor DNA, ctDNA），是指肿瘤细胞释放的，带有肿瘤信息的DNA片段，是血浆游离DNA（cell free DNA，cfDNA）的一部分。 我们所说的ctDNA检测，实际上检测的是全部的cfDNA，再从中分析肿瘤特异的基因变异，也就是说利用肿瘤变异特征来代表其中的ctDNA。ctDNA在cfDNA中的比例波动范围较大，0.01％～90％，受肿瘤分期、转移等影响，大部分在千分之几的数量级，导致cfDNA中能检测到的肿瘤突变频率很低，有研究表明半数以上突变频率在0.4%以下。 因此，ctDNA的检测需要技术灵敏度较高，目前比较适用的技术包括数字PCR技术和结合单分子编码的NGS技术，灵敏度分别可以达到0.01%和0.05%左右。对于晚期肿瘤，敏感性均可达90%以上，可以进行靶向药物指导、疗效监测、耐药监测等分析。但早期肿瘤由于释放的ctDNA少，检出率仍比较低，用于早期筛查尚不成熟。 外泌体：肿瘤细胞的“twitter” 外泌体（Exosome），是一种能被大多数细胞分泌的微小膜泡，具有脂质双层膜结构，直径大约40-100 nm。最近几年，人们发现这种微小膜泡中含有细胞特异的蛋白、脂质和核酸，能作为信号分子传递给其他细胞从而改变其他细胞的功能。研究发现肿瘤细胞释放的外泌体的量较大，这些外泌体与肿瘤的发生、发展、转移以及抗药性具有一定的相关性。因此，可以利用肿瘤细胞释放到血液中的外泌体，检测其中特异的蛋白和非编码RNA等，来分析肿瘤相关的信息。 外泌体的分析主要对象是其中的特异性RNA和蛋白。例如，有研究发现胰腺癌病人血清中GPC1（glypican-1）阳性的外泌体占比显著增高；另有研究者发现，肿瘤会释放携带高水平miR-122的囊泡来营造适合肿瘤转移的土壤，这暗示着肿瘤外泌体中miR-122可能是一个潜在的标志物和药物靶点。 虽然外泌体应用的前景广阔，但目前仍处于研究阶段，其提取、纯化的技术难度较高，对于外泌体中具体标志物的选择，还需要科研上有更多成果的支持。 CTC、ctDNA与外泌体的比较 CTC，ctDNA 和外泌体虽然都是液态活检的检测对象，但各有特色。从本质上来说，CTC，ctDNA 和外泌体，这三者的特征和用途有较明显差异，可以相互补充。下面是三种方法优劣势及应用的比较： 由于肿瘤DNA水平变异研究得最为成熟，而测序技术的发展也为ctDNA检测提供了技术手段。因此，目前ctDNA的应用最为成熟，尤其是在指导用药方面，ctDNA有无可比拟的优势！ -END- 往期回顾 【液体活检口袋书第1期】液体活检是什么？靠谱吗？有前途吗？ 【液体活检口袋书第2期】它绝非仅是组织活检的替代品 参考文献 Zhang W, Xia W, Lv Z, Ni C, Xin Y, Yang L, Liquid Biopsy for Cancer: Circulating Tumor […]

  海普洛斯推出【液体活检口袋书】专栏，对液体活检进行系统、全面的介绍。     第2期，我们将对液体活检的优势进行介绍，期望能使您认识到液体活检的重要意义，它绝非仅仅是无法进行组织活检时的替代选择。   ▼   图：液体活检不仅省时、易得、将痛苦和风险降至最低，更重要的是它能全面地反映肿瘤的状况，这是组织活检无法做到的。       无创   液体活检最显而易见的优势，就是无创。组织活检对于一些不适合手术的患者，就需要进行穿刺活检。然而存在肿瘤的位置较为特殊不适合穿刺，或者患者对于穿刺不耐受的情况，而且更严重的是，穿刺会对肿瘤进一步刺激，容易激发癌细胞的快速增长或诱发转移。这些情况下，液体活检是组织活检的替代方案，然而，液体活检的优势绝不仅仅是这一点而已哦。   图：人类心脏与肺之解剖。当肺部肿瘤生长在靠近心脏的位置时，进行穿刺活检有较大风险，此时可选择以液体活检代替。   临床手段无法检测到肿瘤组织的情况   组织活检主要依赖于影像学检查，然而当肿瘤刚刚发生或治疗后存在残留等情况时，影像学往往难以发现端倪。而血液中却可能存在一些蛛丝马迹，例如肿瘤细胞释放的DNA片段或外泌体等，从而实现肿瘤早期筛查以及术后的复发风险预测等。   早期筛查，是针对健康人群，通过液体活检标志物来预测肿瘤的发生，做到肿瘤的早发现早治疗。目前重点研发的标志物包括ctDNA突变模型、ctDNA甲基化、cfRNA、外泌体等。不过，液体活检进行肿瘤早筛技术上还不成熟，主要原因是早期肿瘤释放的标志物极少，检出率很低，其应用还需要一定的技术突破才能实现了。   实时反映病情变化   也许有人会有疑问，液体活检标志物会不会像抗体一样能够长期存在？是否会出现肿瘤治愈数年后依然能够检测到肿瘤释放的DNA等物质的情况，导致不能反映肿瘤实时的情况呢？   事实上，液体活检标志物的半衰期很短，例如有研究表明ctDNA的半衰期不足2小时，这使得其可以精确反映肿瘤实时信息，达到指导用药、疗效和耐药监测等目的。     图：术后不到30小时，ctDNA便无法检测到了。半衰期短的特点使得ctDNA反映的都是最实时的状况。   实现动态监测   液体活检由于其灵活无创的特点，可以实现对于复发、疗效或耐药的动态监测。影像学的提示往往会滞后，并且仅能显示肿瘤形态的变化，对于肿瘤内部如不同亚克隆间的消长无法分析，而且频繁的检测也有辐射带来的危害。   液体活检往往能够更早提示肿瘤的变化，而且能够提示更为丰富的信息，提前预知复发，根据基因信息动态分析敏感和耐药克隆的变化，及时提示改变用药方案。有研究表明，ctDNA等标志物能够比影像学和CEA等蛋白标志物更准确地反映肿瘤的情况。例如Dawson SJ等就在乳腺癌病人中发现，CTC和ctDNA比蛋白标志物更加灵敏。     图：相比于传统的蛋白标志物CA15-3，ctDNA和CTC的变化更加灵敏。   克服肿瘤异质性   肿瘤在生长过程中，经过多次分裂增殖，其子细胞呈现出分子生物学或基因方面的改变，从而使肿瘤内出现不同的亚克隆，亚克隆间生长速度、侵袭能力、对药物的敏感性、预后等各方面都存在差异。而对于癌细胞已经发生转移的患者而言，不同病灶间的差异会更加明显。   图：肿瘤的异质性。我们必须认识到，肿瘤组织并不是单纯、均一的。如同一个社会中存在各式各样的人，肿瘤组织中也存在各式各样的亚克隆。   这种异质性会导致组织活检出现假阴性，而血液是全身循环的，能够更全面地获取肿瘤信息。如果检测技术灵敏度足够高，液体活检能够达到比组织更高的敏感性，例如Lanman RB等就通过上千例样本检测发现，ctDNA检测敏感性85.0%，高于组织活检的80.7%。如果结合组织活检和液体活检，则可进一步提高阳性率，使更多患者获益。   所以，液体活检绝不仅仅是组织活检无法进行时的替代品，而是能够将基因检测引入肿瘤早期筛查和动态监测的革命性技术！在指导个体化用药方面液体活检也能以其全面、灵活和无创的特点，成为组织活检的良好补充。   往期回顾 […]

海普洛斯推出【液体活检口袋书】专栏，对液体活检进行系统、全面的介绍。 第1期，我们将对液体活检进行概括性的介绍，期望能使您对液体活检有大体的印象。   ▼ 图：卢煜明。堪称液体活检的开山鼻祖。     从煮方便面中得到的灵感   提到液体活检，让我们从它的发现历程说起。上图这位香港中文大学的教授在2016年不仅获诺贝尔生理学或医学奖提名，更成为了被称为“中国诺贝尔奖”的未来科学大奖首届得奖者。他叫卢煜明(Dennis Lo)，被誉为“无创产检之父”。   卢煜明早年在牛津大学做医学生时，知道孕妇要做很多检查，其中一项就是抽胎儿羊水做监测。这项手术有0.5%的流产风险。他当时就想有没有办法从孕妇的血液中找到胎儿的细胞，这样就免去抽羊水存在的风险。1997年，在英国学习、生活了13年的卢煜明回到中国香港，正式开始NIPT技术的研究。偶然地，他从煮方便面的时候获取灵感，把血浆煮沸后，在孕妇血液中找到胎儿DNA，从而发明了无创DNA产前诊断（Non-Invasive Prenatal Testing, NIPT），孕妇产检时不必再使用风险较大的羊水穿刺技术。   图：无创产检。抽母亲的血，查孩子的DNA。   在“煮面”发现DNA后，卢煜明的想法应接不暇，他设想将来把胎儿和癌症的检测进行 “嫁接”。这是从他收治的一个案例得到的启发。   一名孕妇想通过NIPT技术看自己的胎儿是否健康。在检查她的血液后，发现有很多不正常的染色体不是源于胎儿，而是淋巴细胞。最后发现这个孕妇其实患有淋巴癌。在经过一段时间治疗后，血浆检查不再发现这个信号。   “为什么不通过检测血液中癌细胞DNA的含量、动态变化及其他特质来诊断是否癌症呢？”在相同的理论支持下，他当时就决定把癌症和胎儿研究同时做。这一技术，现在被称为“癌症的液体活检”。   液体活检是一门体外诊断技术   液体活检（liquid biopsy），作为体外诊断的一个分支，液体活检就是通过血液或者尿液等体液对癌症等疾病做出分析诊断。目前液体活检主要应用领域是肿瘤的血液检测，即利用血液提示肿瘤发展进程及抗药性等信息，指导个体化精准治疗。与现有肿瘤检测方法相比，液体活检无侵入性、可频繁多次检测及快速反应能力均体现出显着的优势，应用发展潜力巨大。   图：经皮肺组织活检。具有一定风险，需要由经验丰富的医生操作，患者会承受一定的痛苦。     图：液体活检。无痛苦，可重复取样，实时监测疾病动态。   潜力巨大的新兴市场   JP 摩根将液体活检分为早期筛查、诊断分型、药物伴随检测、患者病情检测4 个细分领域，预计全球市场潜力为230 亿美元；高盛也将液体活检应用分为4 个领域，预计其在美国的市场潜力可达到140 亿美元，并预测该市场需要5-15 年才能完全成熟。液体活检领域的专家卢煜明也表示“癌症液体活检未来市场约400 亿美元。根据公开资料上不同机构的预测，我们可以看到，未来液体活检将有百亿美元的市场空间，其中肿瘤的早期筛查占比最大。”     图：液体活检是一个新兴市场，具有巨大的市场潜力。   液体活检克服了组织活检的局限性   液体活检之所以受到越来越大的重视，是因为科学家发现在癌症的诊断和治疗过程中组织活检技术有一定的局限性。主要表现为：肿瘤具有异质性，对于癌细胞已经发生转移的患者而言，仅仅取某个部位的肿瘤组织，并不能反映患者的整体情况，但对所有的肿瘤组织都取样检测又不切实际；某些患者自身的情况决定了他不适合做组织活检；受到手术的扰动之后，有些肿瘤有加速转移的风险；组织活检的滞后性对患者的治疗也是不利的。   图：人们往往以为，肿瘤细胞就像是左边机器中的白球，稳定，均一。实际上肿瘤细胞具备高度异质性（多样性），这就意味着一次组织活检能获得的一小部分肿瘤细胞不能代表整个肿瘤的情况，就像从右边的机器随机喷出的球一样。液态活检克服了这个问题。   而液体活检技术的出现，在理论上能够解决了上述问题，能够更全面、更便捷地进行肿瘤检测，而且可以实现动态监测和早期筛查。这也是液体活检技术被《麻省理工大学科技评论》评选为“2015年十大突破技术”的原因。   图：以肺癌为例，液体活检能实现的目标有至少5个：复发监测，治疗效果监测，个性化治疗，靶向治疗用药指导，发现新的治疗靶点。   液体活检，检的是什么？   液体活检主要检测物包括检测血液中游离的以下物质： […]

海普洛斯推出【液体活检口袋书】专栏，对液体活检进行系统、全面的介绍。 第4期，我们将对ctDNA的发展史进行介绍，期望使您理解ctDNA在液体活检中占据重要地位的原因。 ▼ ctDNA作为现在液体活检最重要的标志物，从其发现到进入临床应用都经历了哪些过程呢？今天就跟大家分享一下ctDNA研究和应用的历史。 首先为大家展现一个timeline，简要地囊括了ctDNA发展史上的重要事件。 1948年 Mandel和Metais发现血浆中存在游离的核酸分子。 1977年 Leon等人发现，肿瘤患者的血浆游离DNA水平要明显高于健康人群，据此推测游离DNA与肿瘤相关。 1989年 Stroun和colleagues报道肿瘤患者的cfDNA中部分来源于肿瘤细胞。 1994年 第一次利用PCR方法在胰腺癌患者血液cfDNA中检测到了KRAS突变，该突变与肿瘤组织中检测到的一致。 2008年 Diehl F.等对18名肠癌患者的ctDNA进行了跟踪，利用BEAMing技术检测APC、KRAS、TP53、PIK3CA等基因热点突变，发现ctDNA突变率随着治疗过程变化，变化趋势与肿瘤负荷及CEA浓度呈正相关。 2012年 Forshew T等人与Michael W等人分别发表文章，利用分子标签的原理过滤NGS中的PCR错误和测序错误，能够显著降低背景噪音，从而提高NGS检测灵敏度，使之适用于cfDNA中超低频突变的检测。 2014年 欧盟EMA批准利用ctDNA检测EGFR突变用于易瑞沙的伴随诊断，标志着ctDNA正式临床应用。 2015年 《非小细胞肺癌(NSCLC)血液EGFR基因突变检测中国专家共识》于《中华医学杂志》上发表，补充了如果肿瘤标本不可评估EGFR基因状态，则可使用从血液(血浆)标本中获得的ctDNA进行评估。 2016年 非小细胞肺癌NCCN指南中添加了液体活检推荐。 通过这条时间线我们可以看到，ctDNA有着数十年的历史。接下来就为大家详细解说，它是如何从孟德尔的发现一路走进NCCN指南的。 cfDNA的发现 血中游离DNA简称cfDNA（Cell-Free DNA），是指循环血中游离于细胞外的部分降解了的机体内源性DNA。 早在1948年，比DNA双螺旋结构发现还早6年的时候，Mandel和Metais就发现血浆中存在游离的核酸分子；1977年，Leon等人发现，肿瘤患者的血浆游离DNA水平要明显高于健康人群，据此推测游离DNA与肿瘤相关。但由于缺乏高灵敏性和高特异性的实验方法，导致有关血中游离DNA与疾病相关性的研究在较长时期内进展缓慢。直到有效分离游离DNA技术的出现，和特殊荧光染料与PCR技术相结合的检测技术的应用，才使这一领域的研究得到了较迅速发展。 ctDNA作为肿瘤标志物地位的确立 1989年，Stroun和colleagues报道肿瘤患者的cfDNA中部分来源于肿瘤细胞；1991年, Sidransky等人研究表明，膀胱癌患者尿沉渣中DNA携带有TP53突变，提示了可以利用基因分析来检测cfDNA；之后陆续在结直肠癌、胰腺癌及肺癌等患者的粪便和痰样本中检测到了KRAS突变。1994年, 第一次利用PCR方法在胰腺癌患者血液cfDNA中检测到了KRAS突变，该突变与肿瘤组织中检测到的一致。也就是说，cfDNA中携带肿瘤特有突变的那一小部分DNA，确确实实是由肿瘤细胞释放出来的。 此后，人们认识到cfDNA中的肿瘤相关突变是肿瘤特异性的标志物，并称这些携带肿瘤特征的cfDNA片段为循环肿瘤DNA（Circulating Tumor DNA，ctDNA）。 技术革新促进ctDNA研究爆发 测序技术限制着ctDNA的研究发展。直到2000年前后，高灵敏度技术开始出现，ctDNA的研究开始爆发。 随着更高灵敏度的数字PCR（digital PCR，dPCR于1999年出现）和BEAMing技术（于2006年出现）的应用，ctDNA的研究逐渐增多。2008年，Diehl F.等对18名肠癌患者的ctDNA进行了跟踪，利用BEAMing技术检测APC、KRAS、TP53、PIK3CA等基因热点突变，发现ctDNA突变率随着治疗过程变化，变化趋势与肿瘤负荷及CEA浓度呈正相关。 然而，dPCR和BEAMing虽然检测灵敏度高达0.01%，但其检测范围仅局限于少许位点，往往需要先对肿瘤组织进行测序挑选特定位点，再进行后续监测，严重限制了ctDNA研究的广度。 单分子编码技术的建立是ctDNA发展史上的一个里程碑。 2012 年，Forshew T等人与Michael W等人分别发表文章，利用分子标签的原理过滤NGS中的PCR错误和测序错误，能够显著降低背景噪音，从而提高NGS检测灵敏度，使之适用于cfDNA中超低频突变的检测（关于这一技术我们会在下一期详细说明）。从此，基于分子标签原理的NGS检测成为ctDNA研究最强大的工具。由于NGS检测范围广的特点，拓展了ctDNA的应用场景，使之可以不局限于特定位点突变频率的检测，还可以进行数十上百个基因的广泛筛查，从而可以应用于药物靶点检测、耐药机制分析、早期肿瘤筛查等方向，ctDNA研究也迎来了爆发期。 2016年ASCO上，美国Guardant Health发布了史上最大规模的ctDNA检测研究结果，其Guardant360平台检测了15191例病人的17628份血液标本和398位病人的组织标本，结果发现，在83%病人的血液中能够检测到ctDNA，血检结果对肿瘤的诊断准确率可高达87% （336/386），若血液检查和组织活检相差六个月内，血检和活检的一致性可高达98%。 ctDNA逐渐走入临床应用 “若组织活检不可重复实行，应考虑进行血浆活检。”——NCCN指南，2017年第4版，非小细胞肺癌。 随着ctDNA研究的逐渐成熟，利用ctDNA进行临床检测也逐渐受到了认可。2014年9月，欧盟EMA批准利用ctDNA检测EGFR突变用于易瑞沙的伴随诊断，标志着ctDNA正式临床应用。2015年12月，《非小细胞肺癌(NSCLC)血液EGFR基因突变检测中国专家共识》于《中华医学杂志》上发表，补充了如果肿瘤标本不可评估EGFR基因状态，则可使用从血液(血浆)标本中获得的ctDNA进行评估。2016年6月，美国FDA批准罗氏cobas […]

最近，液体活检十分被看好，从美国癌症早筛公司Grail宣布9亿美元B轮融资落地，到国际顶尖期刊的研究报道，无论是市场还是科研，均给液体活检的发展带来了好消息。   近日，张鹍教授团队在《NatureGenetics》上发布最新力作——世界首创高通量甲基化无创检测新技术，未来可以用于癌症无创早筛与溯源。该技术利用癌症标记物和组织特异性CpG甲基化模式的双重信号来检测和定位癌症。   此外，Nature上最近刊发了多篇关于液体活检的综述，描述了液体活检在肿瘤领域的应用现状，认为基于ctDNA的液体活检应用前景十分宽广。     1. 液体活检到了成年期   2017年2月22日《NATURE REVIEWS CANCER》发表了一篇题为《液体活检到了成年期：迈向循环肿瘤DNA》的综述（Liquid biopsies come of age: towards implementation of circulating tumour DNA）。该综述通过结合将近250篇已有文献，认为当前是十分令人兴奋的过渡时期，因为ctDNA已经开始应用于临床，尽管游离DNA生物学还有很多尚未解开的谜团。当前也是评价ctDNA分析方法的适当时期，是时候考虑将其应用到肿瘤个性化研究中。   如今临床上紧迫需要新的肿瘤分子诊断工具。传统的抽样方法如穿刺活组织切片除了具有创伤性，还难以获得足够多且高质量的样本用于基因组分析，并且还可能因为遗传异质性而导致采样偏见。疾病的检测和监测往往依赖于体内的流体标记物，而成像检测往往会使患者暴露于电离辐射中，并且这种方法无论在时间还是在空间上的分辨率都是有限的。   ctDNA的近期研成果突出了其在疾病管理各个阶段中的应用潜力，主要包括通过分析ctDNA来量化疾病负担以及分析癌症基因组。基因组学和分子生物学技术的发展扩大了ctDNA潜在的应用范围，包括在研究以及癌症管理上的应用。   理论研究也已经证实了ctDNA在疾病预测、分子分析以及疾病监测上的潜力。PCR技术和高通量测序技术的可用性及可靠性的提高，促进对新型高灵敏度ctDNA的应用力度，同时还生成大量的临床数据集，帮助人们更好地理解cfDNA和ctDNA的起源。     2. 将液体活检整合到癌症管理中   2017年3月2日，《Nature Reviews Clinical Oncology》杂志也发表了一篇液体活检综述，题为《将液体活检整合到癌症管理中》《Integrating liquid biopsies into the management of cancer》。除了血液，其他体液如尿液、唾液、胸腔积液、脑脊液也包含肿瘤衍生的遗传信息。该综述研究了如何使用不同形式的液体活检来指导临床护理，以及最终如何将它们纳入到临床实践中。ctDNA中的分子信息可以进一步补充CTCs（循环肿瘤细胞）、RNA、蛋白质以及外泌体所提供的信息，基于ctDNA的液体活检也是本综述强调的重点。   在癌症发展和治疗过程中，肿瘤细胞的多个亚群体相互竞争，选择压力促进了主导亚克隆的形成，它们是复制以及传播最为熟练的群体，也最不容易治疗。目前手术或组织活检是分析实体肿瘤分子剖面的主要手段，然而这种方法受抽样偏差，仅仅能提高肿瘤异质性的“快照”，并且样本不能重复获取。ctDNA已被证明与肿瘤实时变化密切相关，对分子病理学和临床肿瘤学具有重要的影响，可用来评估耐药性、监测治疗反应以及量化微小残留病灶。   目前，液体活检主要以ctDNA、CTC及外泌体作为肿瘤诊断的生物标志物，那么这三者在具体应用中到底有什么区别呢？我们来看看下表。     本表格翻译自综述原文，表中“Yes”表示方法可行，或者有研究可参考；“No”表示方法不可行或者没有研究可参考。     3. 液体活检已经走进临床应用   Nature上的综述通过分析大量文献，认为液体活检在临床肿瘤学中十分具有应用潜力，尤其是基于ctDNA的液体活检。近年来，基于ctDNA的疾病诊断以及预后判断取得了显著的研究成果，ctDNA检测也成为了实现肿瘤精准治疗最为有力的技术之一，其在肿瘤早期筛查研究中的应用也开始普遍起来。 […]

只有更早地发现肿瘤、发现肿瘤复发、发现肿瘤耐药，才能及时应对，处乱不惊。