循环肿瘤DNA

一年前，号称“女版乔布斯”的Elizabeth Holmes因欺诈罪获刑11年3个月，她曾通过炒作“滴血验癌”的概念狂骗90亿美元。这一事件还被拍成了电影《滴血成金》。   《滴血成金》电影海报 而就在Holmes疯狂炒作揽金的时候，另一群默默无闻的科学家却努力将“滴血验癌”变成了现实。初步的研究结果近日发表在了《柳叶刀》上[1]。 研究中共有6621名参与者通过ctDNA技术进行了多癌种早期检测（MCED），发现了92例癌症疑似患者。其中，35人最终被确诊为癌症，另外57人则为假阳性。阳性预测值和阴性预测值分别达到38%和98.6%，特异性达到99.1%。 作为参考，常规的乳腺癌钼靶筛查的阳性预测值和阴性预测值分别为25.9%和99.6%，更先进些的3D钼靶筛查的阳性预测值和阴性预测值分别为24.1%和99.8%[2]。   血液检查可以说是医院里最常见的一类检查项目，血常规、生化、血沉、癌胚抗原等诸多抽血检查项目为医生了解患者病情提供了很大的帮助。但对于诊断癌症来说，最灵敏的还要数ctDNA。 ctDNA即循环肿瘤DNA，也就是肿瘤细胞死亡破裂后进入血液的DNA片段，血液里检测到ctDNA就意味着身体里可能长了肿瘤，根据ctDNA的甲基化模式也可以大致判断出肿瘤来自哪个器官。 根据MD安德森癌症中心胃肠肿瘤学系教授Scott Kopetz的估计，CT检查大约需要1000万个癌细胞才能发现异常，x光片需要10亿个癌细胞，而ctDNA仅需10万个癌细胞就能发现，比传统的影像学手段灵敏100~10000倍[3]。这也使ctDNA成为筛查肿瘤的一个重要手段。 本次临床研究共招募了6662名参与者，其中6621人完成了MCED检测，包括3681名有吸烟、癌症家族史等癌症危险因素的参与者，和2940名无癌症危险因素的参与者。 在ctDNA检查中，92人被发现为阳性，可能患有癌症。在之后为期1年的随访期间，这92人里有35人被诊断出了共计36例癌症，为真阳性；而另外57人未诊断出癌症，是假阳性。 而ctDNA检测阴性的参与者有6321人进行了癌症状态评估，86人在之后1年的随访期间发现癌症，其中38人是通过常规的癌症筛查发现的，48人是出现临床症状后检查发现的。 根据这些数据计算，ctDNA检测的阳性预测值和阴性预测值分别达到38%和98.6%，也就是检测阳性的患者有38%真有癌症，而检测阴性的患者98.6%都没有癌症。 研究中ctDNA发现的癌症 更重要的是，研究中通过ctDNA发现了1例肝内胆管癌、1例胰腺癌、1例小肠癌和1例梭形细胞癌，而且均处于I~II期，可以手术切除。这些癌症都难以在常规的体检或肿瘤筛查中发现。而对于有筛查手段的肺癌，研究中发现的11例肺癌患者中也有8人不符合低剂量螺旋CT肺癌筛查的标准。 研究人员表示，这项研究确立了ctDNA检测用于癌症早筛的可行性，不过目前还需要更大规模的研究来证明其对癌症死亡率的影响。更重要的是，ctDNA检测目前还比较昂贵，希望随着技术的进步可以在将来逐渐降价，让每个人都用得起。 参考文献： [1]. Schrag D, Beer T M, McDonnell C H, et al. Blood-based tests for multicancer early detection (PATHFINDER): a prospective cohort study[J]. The Lancet, 2023, 402(10409): 1251-1260. [2]. Zackrisson S, Lång K, Rosso A, et al. […]

怎么评估癌症治疗的效果？目前临床上主要的方法还是测量肿瘤大小的变化，以此将患者分为完全缓解（CR）、部分缓解（PR）、病情稳定（SD）、疾病进展（PD）四个类别，给予不同的处理。 最近，基因泰克的Zoe June F. Assaf等人又找到了一个更精细更准确的评估指标——循环肿瘤DNA（ctDNA）[1]。 根据研究人员开发的模型，在SD患者中，ctDNA高危患者的死亡风险是低危患者的1.85倍；在PR患者中，ctDNA高危患者的死亡风险是低危患者的2.18倍。 癌症治疗从来不是一蹴而就，很多患者在癌症的治疗过程中都尝试过许多不同的治疗方案。当前的治疗方案有没有效果？需不需要更换？这就涉及到对治疗效果的评估。 目前的实体瘤反应评估标准（RECIST）主要依靠肿瘤大小的变化作为评估依据：肿瘤缩小了就是治疗有效，可以继续当前的治疗方案；如果肿瘤变大了，往往意味着疾病进展，肿瘤耐药，需要更换方案。 不过在这个免疫治疗的时代，一些患者会出现“假性进展”。明明治疗有效，但由于大量免疫细胞进入肿瘤，反而会出现肿瘤增大的情况。这就导致肿瘤体积的变化并不能很好的反应疗效，那有没有更好的判断标准？ ctDNA是血液中存在的游离肿瘤DNA，通常被认为是坏死或凋亡的肿瘤细胞释放出来的。在可切除癌症中，术后ctDNA阳性已被证明是预后的不良因素[2]。那ctDNA能否用来评估免疫治疗的疗效？ IMpower150试验评估了T药（和/或）贝伐单抗联合卡铂+紫杉醇治疗非小细胞肺癌的效果[3]，研究中也对患者的ctDNA水平进行了监测。 经研究人员评估，IMpower150试验中共有466名患者有准确的ctDNA数据，被纳入本次研究，其中240人被用于训练机器学习模型，226人用来测试模型。 240人的测试集中，基线时85%的患者ctDNA呈阳性。相比于基线ctDNA阴性的患者，ctDNA阳性患者死亡风险升高了33%，中位总生存期短了7.8个月。而且在ctDNA阳性的患者中，也是ctDNA水平较低的患者生存期更长。 随着治疗的继续，ctDNA的阳性率也在逐渐下降。第六周进行首次疗效评估时，ctDNA的阳性率下降到77%左右，而且ctDNA水平的降低和疗效明显相关： ● CR和PR的患者，ctDNA水平平均比基线时下降了70%； ● SD的患者，ctDNA水平平均比基线时下降了39%； ● PD的患者，ctDNA水平平均比基线时上升了54%。 而且，根据第六周时ctDNA还可以进一步将SD和PD的患者各分为高危和低危两组： SD患者中，ctDNA高危患者和低危患者的中位总生存期分别为15.3个月和22.8个月，高危患者的死亡风险是低危患者的1.85倍； PR患者中，ctDNA高危患者和低危患者的中位总生存期分别为14.3个月和未达到，高危患者的死亡风险是低危患者的2.18倍。 在测试集和一个外部队列中，ctDNA也能很好的预测患者的生存期：   SD（左）和PD（右）患者中，ctDNA低危患者生存期更长 研究人员认为，ctDNA一方面可以作为影像学手段的补充，辅助评估患者的治疗效果，实现更好的临床管理。另一方面，ctDNA的应用也能帮助临床试验中的研究人员更早获取有效数据，也让参与临床试验的患者受益。 参考文献： [1]. Assaf Z J F, Zou W, Fine A D, et al. A longitudinal circulating tumor DNA-based model associated with survival in metastatic non-small-cell lung cancer[J]. Nature Medicine, 2023: 1-10. […]

早中期的实体瘤，是可以被治愈的，而且比例并不低。绝大多数1期的癌症，经过手术、放疗等根治性治疗后，治愈率可以高达80%以上。但是，一直以来，并不存在某个指标，可以预判到底哪些病人治疗后已经被治愈。 目前，可以采取的策略就是定期复查，尤其是根治性治疗后5年内，规律的、定期的复查，成为了早中期实体瘤根治性治疗后全程管理的金标准。如果规律定期复查满5年，还没有出现肿瘤复发反弹的任何蛛丝马迹，那么恭喜你，你已经大概率被治愈了（虽然依然有极低的概率出现反例）。 循环肿瘤DNA（ctDNA），是最近几年随着测序技术不断进步而越来越火的一项不算太新的技术。通过检测肿瘤患者外周血中的致癌突变，不仅可以指导靶向药和免疫治疗的选择，而且可以用来选择需要接受辅助治疗（辅助化疗、辅助免疫治疗）的高危人群，同时还有潜力根据治疗后是否一直残留有ctDNA，来预判患者是否已经治愈。 近日，《新英格兰医学》杂志公布一项全球多中心3期临床试验，首次报道了利用ctDNA来选择需要接受辅助化疗的2期肠癌患者，相比于既往用临床标准来判断，有更好的疗效、更低的副作用。 2期的肠癌，经过手术治疗后，有80%左右的患者已经治愈，剩下20%左右的患者会出现复发转移，手术治疗后，通过辅助化疗，可以一定程度降低复发的风险。 既往，临床医生都是通过一套临床经验积累起来的标准，来挑选其中的高危病人进行辅助化疗，毕竟如果让所有的病人都来打化疗，某种程度上讲是一种过度治疗（有80%的病人不打化疗也已经治愈了，你让这80%的病人白白承受了化疗的副作用以及经济负担，肯定不是最佳方案）。 现在，科技进步了，新的处理原则诞生了：患者在手术后的第4周和第7周，分别采1次外周血，检测ctDNA，两次外周血中任意一次ctDNA阳性的患者，被判定为术后复发转移高危患者，推荐进行辅助化疗；如果两次外周血标本中ctDNA都是阴性，那么就无需进行辅助化疗。 这样一种新型的奠定2期肠癌患者中高危人群的方法，和既往临床经验判断高危人群的方法，哪个更靠谱呢？这项3期随机对照临床试验，就是用来比一比到底哪一种策略更牛逼。 455名患者入组，2:1随机分组，302人分到了新策略组（根据ctDNA检测的结果来决定是否打辅助化疗），153人分到了常规治疗组（由主管医生根据临床标准判断是否需要打辅助化疗）。 结果显示：常规治疗组有28%的人被判定需要打化疗，而ctDNA检测组只有15%的患者被判定需要打化疗，一下子少了接近一半人免于打化疗。而治疗效果呢：2年的无疾病复发生存率分别为93.5%和92.4%，无统计学差异。 也就是说，ctDNA组有一半人免于打化疗，但是并未让疗效打折扣。3年的无疾病复发生成率分别是92.4%和91.7%，更加接近。 从这个研究中我们可以初步发现：那些ctDNA阴性的病人，大概率的确是不用接受化疗，本来就已经很接近治愈了；而那些ctDNA阳性的病人，才是术后复发转移的高危患者，通过辅助化疗，可以一定程度降低复发转移概率。 基于这个理念，吴一龙教授在肺癌里，通过更大样本的数据，得出更进一步的猜想。261位1-3期的早中期肺癌患者，手术前、手术后及随访期分别进行了外周血标本的留取，同时进行了ctDNA的检测，从中发现了几大规律： 【1】手术后1个月外周血中是否残留ctDNA可以预判患者是否大概率已经治愈。224名患者在手术后1个月左右留取的外周血中检测不到ctDNA，截止目前这批病人中的194人依然没有复发；21名患者在手术后1个月左右的外周血中可以检测到ctDNA，其中17人已经出现复发。如果把随访期内的外周血ctDNA检测结果也算在内，那么可以发现：如果某个病人手术后1个月和每一次随访的时候检测的外周血ctDNA都是阴性的，那么97%的概率该患者不会在末次ctDNA检测后的半年内复发，而且大概率已经治愈。   【2】在已经出现复发转移的患者中，绝大多数患者在影像学片子上可以检测出复发病灶之前的3-6个月就可以在外周血中检测到ctDNA，事实上87%的已经出现复发的患者，在复发前6个月内收集的外周血中可以检测到ctDNA。   随着外周血ctDNA测序技术的不断进步和价格下降，未来ctDNA检测的用途将越来越广，让我们拭目以待。 参考文献 [1]. Longitudinal Undetectable Molecular Residual Disease Defines Potentially Cured Population in Localized Non-Small Cell Lung Cancer. Cancer Discov. 2022 May 11;OF1-OF12. [2]. Circulating Tumor DNA Analysis Guiding Adjuvant Therapy in Stage II Colon Cancer. N Engl […]

目前液体活检在国内的应用情况如何？ 肿瘤的液体活检主要包括循环肿瘤DNA（即circulating tumor DNA，ctDNA）、游离肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）及外泌体（exosome）。众多研究表明三者与肿瘤的早诊、治疗、预后等均存在相关性。目前在临床应用最多的当属ctDNA检测。   正常人的体液内亦存在来自于机体正常细胞的游离DNA，简称循环游离DNA；在肿瘤患者体内，循环游离DNA不仅仅来自于正常细胞，还有一部分来自于肿瘤细胞，即ctDNA是循环游离DNA的一部分，因此我们可以通过检测ctDNA相关变异状态作为来自肿瘤细胞的标志物。目前临床肿瘤ctDNA检测最常见的应用领域为治疗方案选择及耐药监测。   由于ctDNA具有片段化程度高、丰度低等特点，其主流检测方法包括Cobas法、Super-ARMS法、高通量二代测序（NGS）及数字PCR。      Cobas检测：作为第一个被美国食品药品监督管理局（FDA）批准的ctDNA检测试剂盒，仅对血液ctDNA中的EGFR基因常见突变进行检测，在以上四种ctDNA常用检测方法中敏感度较低；   Super-ARMS法：仅对EGFR基因常见突变进行检测，其通过对传统扩增阻遏突变系统（Amplification Refractory Mutation System，ARMS）法的优化升级，灵敏度更高，可检测低至0.2%丰度的突变，并且于2018年通过中国药监局审批；   NGS：优点在于可同时检测多个基因相关变异，能在最短的时间内对患者肿瘤变异情况做出全面了解，缺点在于操作复杂，费用较为昂贵；   数字PCR检测：为目前最敏感的检测方法，可以识别低至0.03%的突变，但是缺点在于检测通量低，每次仅能检测一个位点，并且仅能检测已知位点的突变。  哪些情况下适合采用液体活检？ 要了解液体活检具体的应用场景，首先应明确液体活检的优劣势。   液体活检最大的优势在于微创、快捷，易于动态监测；一定程度上全面反映肿瘤整体变异状态，不受肿瘤异质性影响；适用人群更广泛，对于难以取得活检肿瘤组织或取得肿瘤组织不够基因检测的患者，液体活检提供了一个了解肿瘤基因变异状态的有效途径。   然而，液体活检最大的劣势在于其并非富集肿瘤的检材，大量的正常组织释放基因组DNA稀释了肿瘤来源的DNA，造成ctDNA突变丰度很低（一般低于1%），对ctDNA突变的检测无异于大海捞针，或者更形象地说：从一堆稻草（正常组织来源的循环游离DNA）中找一根针（来自肿瘤细胞的ctDNA）一样困难，因此对ctDNA的检测方法灵敏度提出了更高的要求。   1. 早期诊断   肿瘤的早期诊断其最大特点为肿瘤负荷很低，可能影像学上都没有明确的肿瘤病灶。此时血液中ctDNA的含量亦极低，普通针对ctDNA突变的检测难以满足早诊的要求。   值得庆幸的是，细胞从癌前状态向癌症发展过程中，DNA甲基化改变是贯穿整个恶性转化的表观遗传学改变。即使在肿瘤发展的最早期阶段，DNA甲基化模式也已经与正常细胞存在显著差异；其次，甲基化水平的改变是具有组织特异性的，即对甲基化进行检测及比对，能够进行器官溯源，发现到底是哪里可能会发生或已经发生了肿瘤。   因此，对ctDNA的甲基化水平进行检测，是一种有效的肿瘤早期筛查辅助手段。比如SEPT9基因甲基化检测试剂盒对结直肠癌诊断的敏感度及特异性可达74.8%及97.5%[1]，现在已经可以作为一种结肠镜前的初筛手段。   2. 指导靶向治疗   肿瘤的靶向治疗是目前临床最常见的ctDNA检测应用场景。根据《非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测中国专家共识》[2]，如果有肿瘤组织，推荐直接用肿瘤组织进行驱动基因检测；但是若没有肿瘤组织样本或者肿瘤组织样本不足的情况下，液体活检可作为很多患者基因检测的首选。   由于中国非小细胞肺癌人群中EGFR为最常见的驱动基因变异（约40%-55%），此时对肿瘤驱动基因的检测，既可以使用Cobas或者Super-AMRS法对EGFR基因常见突变进行检测，也可以使用NGS，一次性对所有肺癌相关驱动基因变异进行全面检测。   但无论是何种检测方式，应注意的是若组织活检或者液体活检有任何一个是阳性，患者就应当考虑使用靶向药物；当液体活检先行的时候，若液体活检为阴性，应提示患者可能存在假阴性，必要时再取活检，以避免错失可能的靶向治疗机会。   3. 耐药监测   靶向治疗终归面临耐药的问题，而液体活检由于微创快捷的优势，是理想的耐药监测材料。对于EGFR一代或者二代TKI用药人群，约半数以上的患者出现EGFR 20号外显子T790M而耐药[3]，因此对于此类患者的耐药监测可使用敏感度高且成本低的数字PCR法对T790M单点进行监测。如果患者已经出现了耐药，亟需探索其耐药机制以更换治疗方案，此时推荐使用NGS对基因变异的整体状态进行检测，以便全面寻找耐药原因。   4. 预后评估 […]

合理利用外周血ctDNA进行疾病监测，或是是未来肿瘤随访的一大利器