血液检测

随着精准医疗的不断发展，靶向治疗在肺癌的临床诊疗中发挥着至关重要的作用。作为进行靶向治疗的必备前提，检测出相应的基因突变才可以为患者制定行之有效的治疗策略。因此，在晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者中，国内外诊疗指南均建议对患者进行基因检测，组织样本检测是目前的“金标准”。而是否能获得组织活检标本、组织活检样本是否足够、质量是否符合检测标准等都是临床实践中面临的难题。 仍有一部分转移性NSCLC患者没有足够的肿瘤样本进行全面的基因检测，同时，为了得到足够组织样本去重复活检则会延长患者的诊断过程，延迟治疗启动的时间[1-3]。基于外周血的二代测序（NGS）的优势在于其能够克服与组织标本检测相关的一些限制，为组织标本不足/不可及的患者缩短启动治疗所需的时间，并指导临床医生用药。 那么，仅对血浆样本的循环肿瘤DNA（ctDNA）进行NGS检测以判断是否存在驱动基因阳性，能否真正筛选出靶向治疗获益的患者呢？BFAST试验应运而生，其旨在前瞻性地评估初治晚期或转移性NSCLC患者中血浆基础生物标志物与靶向治疗或免疫治疗临床疗效之间的关系，其中ALK阳性队列的数据发表于Journal of Thoracic Oncology（JTO）[4]。 图1 官网截图 仅通过血检指导阿来替尼用药，研究者评估的ORR可达 87.4%！ 本试验纳入了年龄≥18岁的IIIB期或IV期NSCLC患者，并允许无症状或经治疗的中枢神经系统（CNS）转移患者入组。入组患者通过FoundationACT（一种液体活检产品，可用于检测62种常见基因突变）进行检测并检测血浆肿瘤突变负荷（bTMB）。 通过血浆NGS检测到的ALK重排患者，每天两次服用阿来替尼600 mg。主要终点是研究者评估的客观缓解率（ORR）。次要终点为独立审查机构（IRF）评估的ORR、缓解持续时间（DOR）、无进展生存（PFS）率、总生存（OS）率和安全性。研究者还评估了基线CNS转移患者的ORR以及循环生物标志物和治疗缓解之间的关系，以此作为探索终点。 本试验目前总共筛查了2219名患者，98.6%的患者获得了基于血浆的NGS结果。其中，119名患者（5.4%）检测出ALK阳性；87人符合标准并接受阿来替尼治疗。中位随访时间为12.6个月（范围：2.6-18.7）。经研究人员确认的ORR为87.4%（95%CI 78.5%–93.5%），经IRF确认的ORR为92.0%（95%CI 84.1%–96.7%）。 研究者确认的12个月缓解持续率为75.9%（95%CI 63.6%–88.2%）。在35名基线CNS转移的患者（40%）中，研究人员评估的ORR为91.4%（95%CI 76.9%–98.2%）。中位PFS尚未达到；研究者评估的12个月PFS率为78.4%（95%CI 69.1%–87.7%）。安全性数据与已知数据一致。 表1 BFAST试验ALK阳性队列疗效结果 BFAST试验能给临床实践哪些启示？ 随着基因检测技术的快速发展，近年来对患者整体人群开展的基因图谱分析所采用的检测手段也逐渐从既往的IHC，PCR，FISH等方法过渡到NGS，分析所得信息广度和深度也显著增加，能够更好地反映特定实体肿瘤的基因突变详情，正如本文所展示的BFAST试验。 BFAST试验是第一个前瞻性地使用基于血浆的NGS识别具有驱动基因突变的NSCLC患者的临床研究。其ALK阳性队列达到了其主要终点，经研究者评估的确认ORR为87.4%，经IRF评估的确认ORR为92.0%，这些数据与ALEX研究接近。本试验的筛查结果显示，ALK突变率为5.4%，与既往文献报道的5%接近，同时高于既往接受基于血浆筛查的人群。 同时，BFAST试验的初步生物标记物分析显示，TP53是影响疗效的不良预后因素。这种关联以前曾在ALK/TP53共突变肿瘤患者中报道过，与TP53野生型肿瘤相比，同时有TP53突变的患者，PFS和OS显著缩短。BFAST试验基因组共突变及其临床影响的进一步分析正在进行中。 目前组织检测仍是肿瘤基因检测的“金标准”，液体活检可以作为组织活检的很好的补充，两者各有优劣，相信随着检测技术的发展，无创的、动态的检测或许能够在肿瘤早筛、治疗、复发监测等方面发挥更大价值，同时液体活检能够克服组织活检带来的肿瘤异质性的问题。ALK突变约占我国肺腺癌患者的4%-6%，临床医生对晚期NSCLC患者展开针对性的基因检测，以精准检测为靶向治疗铺路，让患者尽早用上阿来替尼等合适的新型ALK-TKIs，是改善患者预后的关键。而此次BFAST试验的公布，更是打开了ALK基因检测的“新大门”，或能够为更多无法获得组织样本或组织样本量不够的晚期NSCLC患者提供更多治疗的可能，从而进一步扩大获益人群。 专家简介   袁冬梅 教授 南京大学医学院附属金陵医院（东部战区总医院）呼吸与危重症医学科副主任医师、副教授、医学博士 发表SCI论文10余篇 主持国家自然科学基金青年基金一项，主持江苏省自然科学基金青年基金一项 江苏省“科教强卫工程”青年医学人才   参考文献： [1]Lim C, Tsao MS, Le LW, et al. Biomarker testing and time to treatment decision in patients with advanced […]

从根本上说，肿瘤是一种基因疾病，是细胞由于各种遗传因素或者后天刺激发生了突变，有一些突变改变了参与调节细胞生长和与组织环境相互作用的途径，促使细胞无法控制的恶性增殖，最终成为肿瘤。 关于肿瘤基因检测，很多患者对此知之甚少，针对病友们常见的关于基因检测的问题和误区，小编整理了以下内容供大家参考。   什么是癌症基因？ 人的DNA是遗传物质的载体，而基因就是DNA中真正有含义的片段。癌友之所以会得肿瘤，其根本原因是由于身体因各种内部因素（细胞分裂）或外部影响（破坏DNA的致癌物）导致有害的基因突变产生并累积，最终导致了肿瘤。 什么是癌症的基因检测？ 肿瘤细胞与正常细胞存在差异，最重要的不同就是癌细胞中存在很多基因变异：比如有的基因缺失、有的基因重复，有的基因被替换…，使得它从一个正常细胞变成异常细胞。 基因被替换导致蛋白质异常 如果我们利用先进的医学技术把这些变异的基因找出来，并进行分析，就可以协助临床诊断、指导治疗选择、辅助监测疾病复发和耐药、预估生存期等。   所有的癌症患者都需要进行基因检测吗？ 广义上讲，所有肿瘤患者均需要接受基因检测，因为癌症是基因突变导致的。 基因检测可以帮助患者寻找突变的基因，并以此来指导靶向药物的使用，提高治疗效率； 狭义上讲，根据指南推荐，不同的病种、不同的分期、出于不同的目的，不同的患者，适合分类对待。并不是所有的靶向药使用之前都需要进行基因检测。 国家卫健委之前颁布的《新型抗肿瘤药物临床应用指导原则（2019 年版）》，明确指出：抗肿瘤药物临床应用需在病理组织学确诊后或基因检测后方可使用。 其中也罗列了需要和不需要癌症基因检测的常用的小分子靶向药物和大分子单克隆抗体类药物。 如何选择基因检测方案？ 目前医院和各大基因检测公司都有针对不同人群的各类套餐，总结如下：   单癌种基因检测 例如针对肺癌患者，已知的驱动基因包括EGFR、ALK、KRAS、HER2、BRAF、PIK3CA、AKT、MEK、NTRK和MET，那么只检测这些常见突变的基因就可以了。 这种方案主要针对有明确已知驱动基因的癌种，如非小细胞肺癌、乳腺癌、胃肠道肿瘤、甲状腺癌等，优势在于价格便宜，性价比高。 问题在于检测位点不全，可能会造成遗漏，不能给出全面的用药指导。   全面基因检测 使用新一代基因测序技术，可同时检测上百个癌症相关基因及免疫指标。 最大优势是覆盖面大，一次就能综合了解所有情况，对于没有明确或常见驱动基因的癌种，也有机会匹配到药物，不遗漏任何一个治疗的机会。问题在于价格较贵。 不过，随着新测序技术越来越成熟，全面检测方案最终会替代单癌种检测，但目前还是二者共存的阶段。   做了基因检测就一定有靶向药物可用吗？ 不一定。 首先，绝大部分的肿瘤并不是单纯的由突变导致的，所以很多肿瘤患者可能不存在突变的靶点； 第二，即便检测到突变的靶点，这个靶点现阶段可能没有获批的药物可以使用。 如果没有靶向药物可用大家也不要灰心，可以根据医生的建议选择其他的治疗方案，如化疗或放疗，同时，治疗过程中可以再次进行肿瘤基因检测，看看是否新出现可靶向治疗的突变。   肿瘤基因检测多少钱？ 肿瘤基因检测价格一般取决于需要检测位点的数量，检测数量越多，价格越高，全基因检测应该是最贵的，不同的基因检测公司，定价略有不同，但是相差不会太多。   国内肿瘤单病种基因检测一般在几千元，全基因检测2万元左右，患者可以根据经济条件和肿瘤类型选择合适的基因检测类型，建议去正规的基因检测机构。 基因检测，选择什么样的标本最合适？ 做基因检测，是检测肿瘤细胞的突变，因此需要获取肿瘤细胞。 临床上通常有三种方式： 1.肺癌手术中（或胸水中）得到肿瘤样品。 2.穿刺活检样品，通常是在局部麻醉下，使用很细的针刺入疑似肿瘤，来获取少量细胞用于分析。这样创伤很小，可以避免不必要的手术，对患者影响小。 3. “液体活检”。肺癌的液体活检，主要是指通过分析血液里的癌细胞或者癌细胞释放的DNA进行分析，判断肿瘤突变类型。 这之所以能成功，是因为晚期癌细胞，或者癌细胞的DNA，会经常跑到血液里面，现代技术有可能把它们捕获，进行分析。 我们一般推荐的优劣顺序是：最近手术或活检新取的组织标本>1-2年内的组织标本>最新的血标本>2年以上的旧的组织标本。 血液检测是否准确？ 一组数据公布在2016年的ASCO大会上，研究人员通过一万五千多个样本的研究表明，癌症血液基因检测的临床灵敏度达90%左右。 研究人员通过比较发现，ctDNA检测到的基因突变率与癌症基因图谱中的结果吻合度在92%和99%之间。   例如，与癌症基因图谱中的数据相比，EGFR基因的 ctDNA检测结果吻合度为92%; […]

肿瘤治疗，已经从“千篇一律”的传统治疗，逐步发展到了“量体裁衣”的个性化治疗时代。而基因检测是精准医学时代的肿瘤诊治中的核心检测手段之一。在患者社区，经常看到有的病友纠结要不要做基因检测？   今天，我们就肺癌患者基因检测这个话题，进行以下深入科普。   1 为什么要做基因检测？   答案很简单，为了不化疗，为了使用靶向治疗，为了更好的生活质量、更长的生存期。   目前靶向治疗已经是晚期肺癌的一线治疗方案首选，但是想用靶向治疗，必须首先通过基因检测确定自身肿瘤的“靶标”，对“靶”用药。化疗，是一个让很多患者谈之色变的词，强烈的毒副作用让人望而生畏，对于体质偏差的患者，副作用会更明显。这是由于化疗本身特异性低的原因，杀敌一千自损八百，导致身体中很多正常细胞也被杀死。   靶向治疗也被称精准治疗，是对癌细胞实施精确打击，不光毒副作用大大低于化疗，而且疗效通常也远好于化疗（无疾病生存期和总生存期更长），口服的给药方式更是让患者少受很多罪。在化疗和靶向治疗的选择上，无论医生和患者，毫无疑问首选可行的靶向治疗，但基因检测结果是判断能否使用和使用哪一种靶向治疗的前提。在没有经过基因检测的情况，擅自选用靶向治疗非常不可取。   表1.化疗的恐惧   2 被诊断为肺癌 就一定要基因检测吗？   被诊断为肺癌，不一定要进行基因检测。首先肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，对于小细胞肺癌，目前并没有需要基因检测指导使用的靶向药，临床上一般不会第一时间建议晚期小细胞肺癌患者做基因检测，只能选择放化疗。而非小细胞肺癌中的由吸烟导致的肺鳞癌，通常存在可靶基因突变的可能性也较低，NCCN指南仅建议不吸烟、或鳞癌中混有腺癌成分的、或判定鳞癌使用的标本较小的肺鳞癌患者做基因检测。   肺癌中，靶向治疗临床主要集中在非小细胞肺癌中的肺腺癌，这和肺腺癌的分子分型研究得最为透彻有关，不同的分子分型对应着不同的靶向治疗方案，通过基因检测确定分子分型从而指导靶向治疗方案选择已是晚期肺腺癌患者的必做项目。当然对于确定为肺癌，但病理类型不明的患者，考虑到肺癌中非小细胞肺癌占大多数，这类患者也可选择做基因检测。   图1 肺癌分类（图片来源：自做）   另一方面，是否需要做基因检测和肺癌分期也有关。一般来说，早期肺癌患者在手术切除病灶后，定期随访就好，或者做辅助化疗预防复发，因而基因检测并非必要要求。但是通常临床医生仍然会建议做基因检测，主要是因为如果若干年后，切除的病灶复发转移到了晚期，再次取组织活检可能一方面会受制于晚期患者虚弱身体的承受力，即使患者身体能承受也会存在因为病灶小而散导致取病理组织并不容易，只能使用灵敏度低的血液代替组织做基因检测，在这种情况下，如果有早期病灶的基因检测结果，可以作为参考指导服用靶向药（复发的肿瘤，大部分情况下和原发灶的驱动基因突变情况相同）。再者，当前也有研究表明，个别靶向药物在早期肺癌术后辅助治疗中的表现优于化疗，随着各类研究的推进和新药的问世，可以预见靶向药广泛用于早期肺癌术后辅助治疗将在临床上成为可能。   3 基因检测是送组织好 还是送血液好？   优先送组织。目前血液检测的准确性较差，有出现假阴性的可能，肿瘤组织基因检测是金标准，在无法获得肿瘤组织或取组织较困难的情况下，可以选择血液代替。在一些情况下，还可选择胸水、腹水、脑脊液、胸腔积液等代替组织做基因检测。   4 检测的基因越多越好吗？   越多越好，但综合考虑合适最好。根据非小细胞肺癌NCCN指南推荐，非小细胞肺癌用药相关常见驱动基因包括EGFR、KRAS、ALK、BRAF、ERBB2、MET、ROS1、RET、NTRK1/2/3等11个基因。中国肺癌人群中，EGFR突变比较常见，约占52%，其次为KRAS突变（18.9%），EGFR突变适用的靶向药较多，而KRAS基因突变往往意味着对各类靶向治疗耐药，当前尚未有靶向KRAS的药物获批上市。   因此，肺癌患者做基因检测，应至少包含EGFR基因，最好包含指南提示的全部11个基因。条件允许的情况下，还可使用几百基因大套餐（大panel），大panel基因基因检测结果不光可以反映驱动基因的突变情况指导靶向用药，还可以反映整个肿瘤基因组的突变状态（TMB）从而为免疫治疗用药提供参考。   图2.中国人群肺腺癌基因突变情况（PMID：29700208）   5 对于已经做过基因检测的患者来说 有必要再次做基因检测吗？   有必要。当根据患者基因检测结果服用相应的靶向药一段时间后发生疾病进展，就有必要再次做基因检测，明确耐药的原因，并根据耐药的原因，改用靶向药。最常见的情况时，首次基因检测检出EGFR突变的肺癌患者，使用第一代EGFR靶向药一年左右出现进展，再次基因检测往往会出现的新的EGFR突变，或其它基因的突变（如MET、ERBB2等），在这种情况下需根据检测结果改用靶向药。也有研究表明，在晚期肺癌控制周期中，无论是否进展，定期做血液基因突变动态检测，在出现耐药突变但影像学尚未进展时就改用对应的靶向药能使患者获得更长的生存期。   总之，做好、用好基因检测是战胜肺癌的重要一步，当前可用的肺癌靶向药几乎每年都在增加，越来越多的靶点可用靶向药物针对，也越来越多的患者因为靶向药获得生命的延续，基因检测在肺癌的治疗也将扮演这越来越重要的角色。     “以上信息仅供您参考。如有任何问题，请咨询医疗卫生专业人士”   参考文献： […]

血浆EGFR突变早期清除可作为奥希替尼和第一代EGFR-TKI疗效的预测因子

这种检测可能是用于多种癌症筛查的可行方法

海普洛斯推出【液体活检口袋书】专栏，对液体活检进行系统、全面的介绍。 第8期，我们将对cfDNA全基因组测序技术进行介绍，期望使您熟悉该领域的发展情况。 ▼ cfDNA全基因组测序技术的魅与惑 从无创产检到肿瘤检测 科学研究的一大魅力之处在于，当探究一个问题时，总会伴随有其他的意外发现，同时也有新的问题产生。自然乐于馈赠，亦彰显神秘。cfDNA全基因组测序技术的发展为此做了一个很好的例证。该技术始于无创产前诊断，可以灵敏地检测出妊娠期胎儿染色体倍性异常；然后缘于意外地在无创产前诊断中发现，假阳性结果可能是母体患肿瘤所致，进一步应用到肿瘤诊断领域；再接着通过技术不断改进，又广泛应用于肿瘤研究各个领域，包括驱动变异寻找，耐药机制探究和肿瘤早筛等。 无创产前检测中意外诊断出了肿瘤 液体活检第一个走向临床的产品是无创产前诊断，其原理是：在妊娠期，胎儿的游离DNA片段会穿过胎盘释放到母体外周血中，其在母体cfDNA中的比例约为5%-20%。应用大规模平行测序技术对母体cfDNA进行测序，将比对到各染色体的reads数通过均一化后，可代表每条染色体的数量。含有三条21，18或13号染色体的异常胎儿会释放更多特定染色体的cfDNA到母体血浆中，导致该染色体的reads数比例增加。[1] 一位37岁的母亲，在妊娠第十三周进行了无创产前检测，结果显示13号染色体为三倍体和18号染色体为单倍体的染色体倍性异常。进一步的羊膜穿刺手术却显示胎儿染色体倍性正常。为了排除无创产前技术操作过程中的问题，该孕妇在妊娠第十七周进行了第二次无创产前检测，结果仍显示13号和18号染色体倍性异常。在产后该母亲出现了明显的子宫颈癌症状，并诊断出了子宫颈癌。肿瘤组织检测发现肿瘤细胞染色体倍性异常。真相终于大白：原来异常的无创产前结果是由于母亲患肿瘤所致，那些异常的cfDNA不是来自胎儿，而是由母体肿瘤释放的。[2] 这不是个例，在美国一项针对无创产前假阳性结果的研究中，12.5万的检测样本中，3700多例结果为阳性，其中39例出现多条染色体倍性异常， 这其中的10人进一步被诊断出患有肿瘤，并且她们生下的胎儿都是正常的。因此，当无创产前的检测结果和进一步的羊水穿刺结果不一致时，母亲约有20%-44%的风险患有肿瘤。[3] 技术更新带来肿瘤领域的广泛应用 而上面的问题更容易让我们深入思考，是否我们可以用无创产前技术来做肿瘤诊断？大量的肿瘤基因组测序结果表明，肿瘤基因组总会有染色体结构变异，甚至某些基因组区域的拷贝数变异和融合是肿瘤的驱动突变，在肿瘤的发生和进化过程中起到了关键作用。是否我们可以利用该技术来检测肿瘤患者基因组染色体结构变异，以此来做肿瘤诊断？ 在一项应用无创产前技术对16例早期和16例晚期卵巢癌患者进行检测的研究中，分别占6/16和7/16的早期和晚期患者中检测到了>15M染色体区域的倍性异常。[4] 这个结果差强人意，但这其实只是无创产前技术上的限制，无创产前技术的cfDNA全基因组测序深度仅有0.1X-0.2X，同时由于CNV算法上的原因，其能检测到染色体倍性改变的区域仅限于大于15M的大区域。如果我们增加测序深度，并改进算法，相信可以检测到小区域内的染色体倍性区域改变，而这些染色体小区域的改变在肿瘤基因组中更常见。果然在另一项研究中，研究者在加大了测序深度，并改进了基因组拷贝数变异算法后，可以检测到小于5M区域的染色体结构变异，在肿瘤患者中检测到亚染色体区域异常的灵敏度达到了29/31。[5] 在目前测序成本较高的情况下，进行高深度的cfDNA全基因组测序并不现实，于是发展出了新的折中模式：低深度全基因组测序+高深度区域靶向测序。低深度全基因组测序可以检测出大区域的染色体结构变异，为了进一步深入研究小区域内的基因组拷贝数变异，可以进行区域靶向高深度测序。这样便可以较全面有针对性的检测出肿瘤染色体结构变异。该技术很快便广泛应用于与肿瘤拷贝数变异相关的驱动变异寻找，治疗检测和耐药机制探究等领域。[6-8] 在肿瘤早筛中的机遇与挑战 在肿瘤研究领域，肿瘤早筛是目前难以跨越的高峰。因为在肿瘤发生早期，癌变的细胞数目非常有限，常规的影像学和蛋白分子标记等检测手段无能为力。来自于受检者外周血中的cfDNA，可以动态全面的反映受检者基因组状况，因此是绝佳的肿瘤早筛研究对象。早期肿瘤细胞释放到血液中的ctDNA量同样非常有限，其在cfDNA中的含量一般在万分之一以下，因此想检测到ctDNA中SNV和INDEL水平上的变异，对于目前的DNA检测技术来讲，非常具有挑战性。但是我们可以利用cfDNA全基因组测序技术，检测其是否有染色体结构异常，即便是万分之一以下的变异，技术上也是可行的。 然而，利用该技术进行肿瘤早筛，仍然困难重重：首先，我们需要获得健康人的cfDNA染色体倍性基线，cfDNA有独特的断裂方式，释放到血浆中的cfDNA并不是均匀覆盖基因组，因此健康人基线对于灵敏检测非常关键。其次，要想获得合理的测序深度和染色体结构变异算法，需要不断的技术优化。最后，能否检测到特异的染色体结构变异，以此作为肿瘤早筛的分子标记，尚需要事实来说话。 -END- Reference [1]PrasadV., Non-invasive, serum DNA pregnancy testing leading to incidental discoveryof cancer: A good thing?,Eur J Cancer (2015),http://dx.doi.org/10.1016/j.ejca.2015.07.029 [2]OsborneCM, Hardisty E, Devers P, et al. Discordant noninvasive prenatal testingresults in a patient subsequently diagnosed with […]

海普洛斯推出【液体活检口袋书】专栏，对液体活检进行系统、全面的介绍。 ▼ ctDNA检测技术 针对ctDNA中的超低频突变，海普洛斯基于单分子编码原理开发了CUBE-ctDNA专利技术。该技术通过优化测序文库的制备过程，采用三步法：制备、连接、富集，完成对ctDNA的单分子编码标记，有效地过滤二代测序PCR错误及测序错误，结合10000X测序深度，可提高检测灵敏度至0.05%。 另外，常规的开源分析软件对于超低频突变的检出准确性差，因此，海普洛斯针对ctDNA的测序数据分析建立了全新的软件体系，并且将其中很多一部分，以项目名OpenGene（详情见：https://github.com/OpenGene）进行了开源，包括：AfterQC数据过滤和质控、SeqMaker测序数据模拟、MutScan突变扫描和可视化、MrBam测序数据的重复性分析、CfdnaPattern血浆循环DNA的模式识别、FusionDirect融合基因的检出、DeepSomatic基于深度学习的遗传/体细胞突变分类等。这充分显示了海普洛斯在ctDNA检测分析上的实力，也展示了海普洛斯的精神，那就是：开创，开放，开源！ 结合测序技术和分析能力，我们进行ctDNA检测的敏感性大大提高。通过155例样本的测试（其中组织EGFR阳性63例，阴性92例），ctDNA检测敏感性达90.5%，特异性达到98.9%。 肺癌ctDNA检测 EGFR阴性检出率 EGFR阳性检出率 ctDNA与肿瘤组织一致性 98.9% 90.5% 95.48% 表：海普洛斯肺癌ctDNA检测数据   万人癌症基因组计划 万人癌症基因测序计划，是中国首个大型癌症“精准医疗”计划。该计划由深圳市海普洛斯生物科技有限公司携手深圳市人民医院联合启动。该计划针对肺癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、肝癌等五种中国人群高发癌症，旨在实现10，000人的癌症早期筛查、预后监测、个体化用药指导，建立中国首个大型癌症基因数据库，为实现精准医疗奠定基础。 海普洛斯通过该计划，已收集数千例ctDNA样本，利用这些数据建立基线，区分正常人即会携带的cfDNA突变与肿瘤特异ctDNA突变，能够帮助我们进一步过滤假阳性突变，获得更高的检测准确率。 图：海普洛斯的数据积累   ctDNA与用药指导 海普洛斯基于CUBE-ctDNA技术，开发了一系列ctDNA检测指导肿瘤用药的产品，这一系列称为海普安可(HapOnco™)，主要用于肺癌、结直肠癌、乳腺癌等实体肿瘤靶向药物的用药指导。 海普洛斯也在积极更新和开发新产品，比如针对免疫治疗的用药指导。免疫检查点抑制剂已经在多种肿瘤中显示良好的疗效，但如何筛选适用人群仍然没有定论，其中突变负荷可能是很重要的一个指标。我们正在积极开发基于ctDNA的突变负荷检测产品，这正是基于专用的软件和大量数据建立的基线，能够更准确地识别出ctDNA中的变异。 ctDNA与肺癌早期诊断 在低剂量螺旋计算机断层扫描（low-dose computed tomography, LDCT）肺癌筛查中会发现大量的结节。目前对于肺结节的良恶性判断主要包括临床和影像学判断。临床评估，包括年龄、性别、职业、吸烟史、费病史和家族史等。 然而在临床应用中，大多数结节是由感染、炎症所形成，为良性结节。在美国国家肺癌筛查试验中，CT筛查组中96.4%的阳性结节为良性。根据统计显示，应用LDCT筛查肺结节直径在5-10mm的患者肺癌发生率为0.9%～5.8%，直径>10mm患者肺癌发生率为11.1%～26.2%。对于LDCT应用于肺癌筛查的假阳性患者，特别是直径<10mm肺结节患者，会导致过度诊断和治疗及增加受检者焦虑。 利用ctDNA检测中癌基因、抑癌基因的突变信息，可以辅助肺结节良恶性的诊断。海普洛斯通过对这些突变构建模型，结合影像学结果进行分析，前期预试验准确率达到74%。目前模型仍在不断优化中，而更大规模的全国多中心临床试验也即将开始。 以上介绍的只是海普洛斯工作中的一部分，我们还会积极创新开发出更多新技术和产品，为肿瘤的预防与治疗提供技术手段，让每一个生命健康120年！ -END-   往期回顾 【液体活检口袋书第6期】ctDNA的四大应用 【液体活检口袋书第5期】ctDNA检测的终极武器 【液体活检口袋书第4期】从孟德尔的发现到NCCN指南：ctDNA的成长之路 【液体活检口袋书第3期】液态活检三大标志物介绍 【液体活检口袋书第2期】它绝非仅是组织活检的替代品 【液体活检口袋书第1期】液体活检是什么？靠谱吗？有前途吗？ 参考文献 1.Chen S, Han Y, Guo L, Hu J, Gu J, SeqMaker: A Next Generation Sequencing […]

海普洛斯推出【液体活检口袋书】专栏，对液体活检进行系统、全面的介绍。 第6期，我们将对ctDNA的应用进行介绍，期望使您掌握目前ctDNA在各方面应用的理论基础和进展情况。 ▼ ctDNA的应用 ctDNA检测由于实时、无创、灵活等特点，可以应用于肿瘤的各阶段，解决不同的问题，从早期筛查、辅助诊断、预后判断、到靶向用药指导、疗效及耐药监测等。 由于ctDNA含量与肿瘤负荷、肿瘤分期、转移等密切相关，所以目前晚期肿瘤的用药及监测等应用相对更加成熟；而对于早期肿瘤的筛查与诊断，技术上难度更高，整体上仍处于科研阶段。 图：ctDNA含量在转移癌和原位癌、不同分期间的差异。   靶向用药指导 在靶向用药指导上，可以说ctDNA已经确立了江湖地位了。一方面，样本易获取，在组织样本无法获得时可以作为替代品；而另一方面，ctDNA的全面性也可以避免很多肿瘤异质性带来的假阳性。 以Guardant Health的数据为例，我们可以看出，组织和血液互为参照的话，假阳性率都很低，但都存在一定假阴性，血液的敏感性甚至高于组织！也就是说，血液检测的结果绝不只是组织的替代品，而是一个有效的补充。如果血液和组织同时检测，能够进一步提高检出率，使更多患者受益。 图：cfDNA与组织检测同时进行，可使诊断准确率上升。 另外，组织和血液的阳性结果，对于用药来说，意义是等同的。例如，在AZD9291的临床试验中，组织和血液阳性样本对药物的反应率一致，单样本阳性和双样本阳性的患者生存获益没有差异。 图：左为组织，右为血液。   动态监测 ctDNA中肿瘤相关的突变频率，会随着肿瘤的进展和治疗而动态变化，因此监测这些突变频率的变化过程，可以指示治疗的疗效、耐药以及肿瘤复发等。 早在2008年，Diehl F.等就发现，APC、KRAS、TP53、PIK3CA等基因热点突变的频率会随着治疗过程变化，变化趋势与肿瘤负荷呈正相关。 图：ctDNA可以作为动态监测的工具。 同样，ctDNA突变频率的变化也可以指示复发，例如Reinert T.等人通过ctDNA的监测与CT和蛋白标志物的对比，发现在部分病例中，ctDNA频率的升高，要早于影像学和蛋白标志物的变化，以便于尽快采取治疗措施。 图：ctDNA是更为灵敏的蛋白标志物。   预后判断 术后ctDNA的检出情况可以提示预后，利用ctDNA特征突变是否检出、突变频率值或术前术后突变频率的变化，均可以作为预后的判断指标。 图：利用ctDNA是否检出对复发风险的判断要优于CEA。 图：ctDNA突变频率与生存率负相关。   早期筛查与诊断 由于ctDNA释放较少，肿瘤早期的筛查与诊断的难度更高。另外，肿瘤的个体差异导致，难以用少数几个基因状态来衡量所有人，必须需要上百甚至上千个肿瘤相关基因，来建立一个复杂的模型，通过对突变、甲基化等情况的分析来综合考量。 目前，尚没有见到前瞻性研究的成果，不过，已有一些回顾性的研究预示着这种应用的可行性。海普洛斯通过数十例的前期样本，通过ctDNA上百个基因突变的模型，判断肺结节良恶性，并区分病理类型，达到了70%以上的敏感性和特异性；另外，ctDNA甲基化也可用来进行肿瘤诊断和组织溯源。例如，卢煜明教授团队发现，利用ctDNA低甲基化来判断肝癌，可以达到74%的敏感性和94%的特异性；2015年，他们又发文章表示，ctDNA甲基化模式可以区分组织来源。 相信随着研究规模的扩大，大数据与机器学习等手段的运用，利用ctDNA进行肿瘤筛查和诊断也将逐渐成为可能！ -END- 往期回顾 【液体活检口袋书第5期】ctDNA检测的终极武器 【液体活检口袋书第4期】从孟德尔的发现到NCCN指南：ctDNA的成长之路 【液体活检口袋书第3期】液态活检三大标志物介绍 【液体活检口袋书第2期】它绝非仅是组织活检的替代品 【液体活检口袋书第1期】液体活检是什么？靠谱吗？有前途吗？ 参考文献 1.Bettegowda C, et al. Detection of Circulating Tumor DNA in Early- and Late-Stage Human […]

作者：芒果 今早我跟往常一样去公交站，跟路边卖早餐的大姐打招呼，她笑着说：“今天修路，你那趟公交改路线了，你别坐了”。我心领神会地微笑，心想大姐也玩愚人节的梗啊！然后上了车……我就看着公交车带我绕圈，离目的地越来越远…… 虽然今天的内容是在愚人节插播的，但是为咚友们争取福利，我们一向是认真的！ 上期回顾：聪明的肿瘤患者，从不把自己交给运气！（文末大彩蛋） 活动中免费送出一份价值18600元的基因检测服务，我们是认真的！ 针对确有基因检测需求的咚友们申请团购优惠活动，我们也是认真的！ 这次于3月31日结束的基因检测团购优惠活动，获得了咚友们的大力支持，多位已付订金的咚友现已组团成功，获得了咚咚肿瘤科赠出的数千元现金券。但活动结束后，仍有很多咚友联系我们，强烈希望能争取参加此次团购优惠！ 部分咚友表示确实是由于时间关系，遗憾错过深感可惜。考虑到大家的情况，咚咚现破例申请将此次团购活动期限延长至4月10日，期间参加报名的人数仍将继续累积，争取更大优惠。这也将是报名550基因检测团购活动的最后一次机会！以后将绝不会再有了哦！ 与此同时，已于3月31日前参与本次团购的咚友们也有惊喜！如果后续团购人数足够多，截止4月10日后，我们能申请到比目前更大的优惠的话，大家也仍可以享受最终优惠价，大家多支付的差价还将会退还哦，一起期待吧！ PS：为咚友们争取福利，我们从来都是说到做到的！刚才BOSS 特别交代：如果这次参与团购的人数超过萝卜医生的年龄，他还要再送更多福利！其实，我倒是不担心他是不是在开愚人节的玩笑，我主要是担心萝卜医生的年龄一直就是个谜呢……那究竟团购人数能不能超过萝卜医生的年龄呢，留言区等着你们的神评论哦！

海普洛斯推出【液体活检口袋书】专栏，对液体活检进行系统、全面的介绍。 第5期，我们将对ctDNA的关键技术细节进行介绍，期望使您深刻理解ctDNA在液体活检中占据重要地位的原因。 ▼ ctDNA中的肿瘤信息就像是宝藏吸引着科学家们的眼光，然而要想探索宝藏，首先要得到绝世神兵，今天就给大家介绍下这把终极武器的妙用吧！ ctDNA检测 为什么需要更高灵敏度的技术？ ctDNA的检测，相比于组织活检，有更高的灵敏度要求。这其中最重要的原因，就是我们目前没有办法单独获取来自于肿瘤的游离DNA！所谓ctDNA检测，是检测所有cfDNA后分析肿瘤特异性的变异，并将携带这些变异的DNA片段视作ctDNA。 图：从一堆游离DNA中挑出来自肿瘤的游离DNA，可不是一件容易的事儿。 然而，机体的肿瘤细胞相比于正常细胞的数量，简直是九牛一毛。当然这也跟肿瘤的大小、分期、转移等是相关的，不同患者间ctDNA占cfDNA的比例变化范围很大，可从0.01%-90%，大多在千分之几的级别。所以，ctDNA的突变频率明显低于组织活检，有研究表明，有半数以上的突变频率低于0.4%！ 图：半数以上的突变频率低于0.4%。突变如此低频，技术须更灵敏。   常用检测技术为什么难以满足需求？ 目前常用的ctDNA检测技术主要有以下几种： 技术 适用性 灵敏度 ARMS-qPCR 组织突变检测 1% NGS 多基因扫描 1% dPCR 位点监测 0.01% BEAMing 位点监测 0.01% ARMS-qPCR操作简便，且有成熟试剂盒。NGS的检测范围广，能同时检测突变、扩增、融合。然而这两种技术都存在灵敏度低的问题，特别是NGS，更需要降低背景噪音的技术。 dPCR和BEAMing的灵敏度足够高，但两者都存在检测位点数目少的局限性，因而不适合用于用药指导。 ARMS-qPCR (Amplification Refractory Mutation System)方法是临床上常用的组织活检突变检测方法，简便易行，大多数医院都可以自行操作。然而在液体活检中，这1%的灵敏度可就不够看了，会导致大量假阴性的出现。《非小细胞肺癌(NSCLC)血液EGFR基因突变检测中国专家共识》中提到，与肿瘤组织相比，基于ARMS方法的ctDNA检测敏感性相对较低，在IPASS、IFUM和IGNITE三项研究中分别为43. 1%、65. 7%和49. 6%，这种敏感性显然是不能满足需求的！ dPCR（digital PCR）和BEAMing的检测方式类似，通过将反应体系细分来提高灵敏度。我们可以理解成一个集成的qPCR反应，将反应体系分成成千上万个，每个反应中含有一个模板DNA分子，通过识别阳性反应数来实现模板分子的绝对定量。反应体系越多，能达到的灵敏度就越高。这两种方法的优势自然是灵敏度，高达0.01%甚至0.001%。然而，我们也能看出，灵敏度跟模板分子数量相关，所以对样本量要求较大，10ml血液往往仅能检测有限几个位点。目前，主要应用在于特定位点的疗效跟踪和耐药监测，对于用药指导、早期辅助诊断等则不适用。 NGS由于存在大量背景噪音，会淹没频率在1%以下的突变，也因此限制了测序的准确度。也就是说，普通的NGS用于ctDNA检测，其结果将会与ARMS-qPCR半斤八两，但为什么NGS技术在ctDNA研究中反而应用越来越广泛呢？这就要归功于今天的主角——分子标签技术了！ 分子标签技术是什么？ 它是如何提高NGS检测灵敏度的？ 要理解分子标签技术的作用，首先要理解NGS的背景噪音来源。NGS有另外一个名字，叫深度测序，也就是说，对于一个位点，需要很多个DNA片段覆盖它，才能够进行准确分析。在这过程中，需要经过模板的PCR扩增，而DNA聚合酶可能会连接上一个错误的碱基，导致错误；另外，测序系统最后的信号识别也会发生错误。当然，常规情况下，我们不知道这些是真突变还是系统错误，而系统错误又极多，所以只能根据突变频率将背景噪音全部过滤，同时低频的真突变也会被殃及，这就是为什么背景噪音是限制灵敏度的原因了。 2012年5月，Forshew T等人率先发表文章，开发了基于分子标签的TAm-Seq方法。2012年9月，Michael W等人也发表文章，利用双链分子标签，将错误率显著降低，其中双链匹配的数据中，错误率可降低至∼0.001% mutations/bp！当然，实际应用中很难达到这么高，但也足够将灵敏度提高到0.1%以上了。 分子标签技术是在DNA模板上连接一段随机序列，相当于给每一个DNA模板加上一个独特的分子标签，从而可区分不同来源的模板。这样在进行数据分析时，可以根据标签序列识别同一DNA模板扩增出的片段，把它们统一分析，从而过滤掉PCR错误及测序错误，提高检测灵敏度和准确性。 图：双链分子标签原理图。 如图中显示的就是双链分子标签的分析原理，α和β就是一段随机的DNA序列，不同的DNA模板连接的α和β是不一样的。我们可以通过α和β序列来识别同一模板来源的片段，同时根据α和β互补识别同一模板来源的正反义链（单链分子标签相当于只有α，就无法实现这个功能了）。 左侧显示的是一个PCR扩增后期引入的错误或一个测序错误，仅影响少数DNA序列，由于同一模板来源的片段理应序列相同，因此利用少数服从多数的原则就可以过滤掉；中间部分显示的是一个PCR扩增早期引入的错误，影响了正链所有序列，但反链无突变，而碱基互补是DNA双链的基本原则，因此这种错误也可以得到校正（仅双链分子标签可以实现）。 通过分子标签技术，可以大幅降低NGS的背景噪音，从而提高测序准确度，显然双链标签比单链标签的过滤能力更强！然而，虽然原理上容易理解，科研上也逐渐得到广泛应用，但实现应用起来却存在接头连接效率低、双链互补数据比例少等问题，需要不断优化，还要开发配套的信息分析系统。因此能够实现其应用的公司就寥寥可数了！这些公司的NGS液体活检技术会有所差别，但背景噪音过滤的原理都基于分子标签。 海普洛斯通过不断优化，开发出专利的CUBE-ctDNA测序技术，基于双链分子标签的原理，将检测灵敏度提高至0.05%。 基于分子标签技术的NGS技术，集合了检测范围广和高灵敏度的优势，在肿瘤用药指导、早期诊断、早期筛查、预后判断、耐药机制分析等方面，势必会得到越来越广泛的应用！后面的文章会陆续介绍给大家。 最后要吐一个槽：一切脱离技术原理吹嘘灵敏度的行为都是耍流氓！ […]

海普洛斯推出【液体活检口袋书】专栏，对液体活检进行系统、全面的介绍。 第3期，我们将对液体活检的三大标志物进行介绍，期望使您掌握液体活检三大标志物各自的优势、不足及应用范围。 ▼ 图：液体活检三大标志物。 肿瘤液体活检是一个广义的范畴，目前主要是利用血液中的标志物来反映肿瘤的特定信息。这些标志物主要包括CTC、ctDNA、外泌体（exosome）,今天我们就来简要介绍这三种标志物。 CTC：一整个肿瘤细胞 循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell, CTC），是指从实体瘤中脱离出来并进入外周血液循环的肿瘤细胞。1869年，澳大利亚学者Ashworth在一例转移性肿瘤患者血液中首次观察到从实体肿瘤中脱离并进入血液循环的肿瘤细胞，并率先提出了CTC的概念。 CTC数目往往很少，而血液中血细胞的数量则非常庞大（1ml血液中白细胞400-1000万个），要想检测CTC，关键在于根据CTC的物理学特征（大小、密度、电荷、可变形性）和生物学特征（表面抗原、侵袭性等），来实现CTC从血液中的识别和富集。 根据CTC往往比血细胞要大个点儿来识别显然不那么靠谱，然而利用抗原来识别也面临很多问题，需要预先知道要寻找的细胞的特异抗原，而且并非所有CTC都有着相同的抗原特征。如果设定的抗原特异性稍差，哪怕是99.99%的特异度，也会导致成百上千个白细胞掺入；而根据特定抗原来识别CTC的敏感性也是不容乐观，可能会错过大量不含有该抗原的CTC。 目前FDA和CFDA有批准的CTC检测产品，均是根据肿瘤细胞特定抗原对CTC进行计数，利用血液中CTC数目提示疗效、预后等信息。而CTC的富集和后续分析，目前还很少有应用，一是技术难度大，更重要的是少数几个CTC很难完整反映肿瘤完整的信息。 ctDNA：带有肿瘤信息的DNA片段 循环肿瘤DNA（Circulating tumor DNA, ctDNA），是指肿瘤细胞释放的，带有肿瘤信息的DNA片段，是血浆游离DNA（cell free DNA，cfDNA）的一部分。 我们所说的ctDNA检测，实际上检测的是全部的cfDNA，再从中分析肿瘤特异的基因变异，也就是说利用肿瘤变异特征来代表其中的ctDNA。ctDNA在cfDNA中的比例波动范围较大，0.01％～90％，受肿瘤分期、转移等影响，大部分在千分之几的数量级，导致cfDNA中能检测到的肿瘤突变频率很低，有研究表明半数以上突变频率在0.4%以下。 因此，ctDNA的检测需要技术灵敏度较高，目前比较适用的技术包括数字PCR技术和结合单分子编码的NGS技术，灵敏度分别可以达到0.01%和0.05%左右。对于晚期肿瘤，敏感性均可达90%以上，可以进行靶向药物指导、疗效监测、耐药监测等分析。但早期肿瘤由于释放的ctDNA少，检出率仍比较低，用于早期筛查尚不成熟。 外泌体：肿瘤细胞的“twitter” 外泌体（Exosome），是一种能被大多数细胞分泌的微小膜泡，具有脂质双层膜结构，直径大约40-100 nm。最近几年，人们发现这种微小膜泡中含有细胞特异的蛋白、脂质和核酸，能作为信号分子传递给其他细胞从而改变其他细胞的功能。研究发现肿瘤细胞释放的外泌体的量较大，这些外泌体与肿瘤的发生、发展、转移以及抗药性具有一定的相关性。因此，可以利用肿瘤细胞释放到血液中的外泌体，检测其中特异的蛋白和非编码RNA等，来分析肿瘤相关的信息。 外泌体的分析主要对象是其中的特异性RNA和蛋白。例如，有研究发现胰腺癌病人血清中GPC1（glypican-1）阳性的外泌体占比显著增高；另有研究者发现，肿瘤会释放携带高水平miR-122的囊泡来营造适合肿瘤转移的土壤，这暗示着肿瘤外泌体中miR-122可能是一个潜在的标志物和药物靶点。 虽然外泌体应用的前景广阔，但目前仍处于研究阶段，其提取、纯化的技术难度较高，对于外泌体中具体标志物的选择，还需要科研上有更多成果的支持。 CTC、ctDNA与外泌体的比较 CTC，ctDNA 和外泌体虽然都是液态活检的检测对象，但各有特色。从本质上来说，CTC，ctDNA 和外泌体，这三者的特征和用途有较明显差异，可以相互补充。下面是三种方法优劣势及应用的比较： 由于肿瘤DNA水平变异研究得最为成熟，而测序技术的发展也为ctDNA检测提供了技术手段。因此，目前ctDNA的应用最为成熟，尤其是在指导用药方面，ctDNA有无可比拟的优势！ -END- 往期回顾 【液体活检口袋书第1期】液体活检是什么？靠谱吗？有前途吗？ 【液体活检口袋书第2期】它绝非仅是组织活检的替代品 参考文献 Zhang W, Xia W, Lv Z, Ni C, Xin Y, Yang L, Liquid Biopsy for Cancer: Circulating Tumor […]

  海普洛斯推出【液体活检口袋书】专栏，对液体活检进行系统、全面的介绍。     第2期，我们将对液体活检的优势进行介绍，期望能使您认识到液体活检的重要意义，它绝非仅仅是无法进行组织活检时的替代选择。   ▼   图：液体活检不仅省时、易得、将痛苦和风险降至最低，更重要的是它能全面地反映肿瘤的状况，这是组织活检无法做到的。       无创   液体活检最显而易见的优势，就是无创。组织活检对于一些不适合手术的患者，就需要进行穿刺活检。然而存在肿瘤的位置较为特殊不适合穿刺，或者患者对于穿刺不耐受的情况，而且更严重的是，穿刺会对肿瘤进一步刺激，容易激发癌细胞的快速增长或诱发转移。这些情况下，液体活检是组织活检的替代方案，然而，液体活检的优势绝不仅仅是这一点而已哦。   图：人类心脏与肺之解剖。当肺部肿瘤生长在靠近心脏的位置时，进行穿刺活检有较大风险，此时可选择以液体活检代替。   临床手段无法检测到肿瘤组织的情况   组织活检主要依赖于影像学检查，然而当肿瘤刚刚发生或治疗后存在残留等情况时，影像学往往难以发现端倪。而血液中却可能存在一些蛛丝马迹，例如肿瘤细胞释放的DNA片段或外泌体等，从而实现肿瘤早期筛查以及术后的复发风险预测等。   早期筛查，是针对健康人群，通过液体活检标志物来预测肿瘤的发生，做到肿瘤的早发现早治疗。目前重点研发的标志物包括ctDNA突变模型、ctDNA甲基化、cfRNA、外泌体等。不过，液体活检进行肿瘤早筛技术上还不成熟，主要原因是早期肿瘤释放的标志物极少，检出率很低，其应用还需要一定的技术突破才能实现了。   实时反映病情变化   也许有人会有疑问，液体活检标志物会不会像抗体一样能够长期存在？是否会出现肿瘤治愈数年后依然能够检测到肿瘤释放的DNA等物质的情况，导致不能反映肿瘤实时的情况呢？   事实上，液体活检标志物的半衰期很短，例如有研究表明ctDNA的半衰期不足2小时，这使得其可以精确反映肿瘤实时信息，达到指导用药、疗效和耐药监测等目的。     图：术后不到30小时，ctDNA便无法检测到了。半衰期短的特点使得ctDNA反映的都是最实时的状况。   实现动态监测   液体活检由于其灵活无创的特点，可以实现对于复发、疗效或耐药的动态监测。影像学的提示往往会滞后，并且仅能显示肿瘤形态的变化，对于肿瘤内部如不同亚克隆间的消长无法分析，而且频繁的检测也有辐射带来的危害。   液体活检往往能够更早提示肿瘤的变化，而且能够提示更为丰富的信息，提前预知复发，根据基因信息动态分析敏感和耐药克隆的变化，及时提示改变用药方案。有研究表明，ctDNA等标志物能够比影像学和CEA等蛋白标志物更准确地反映肿瘤的情况。例如Dawson SJ等就在乳腺癌病人中发现，CTC和ctDNA比蛋白标志物更加灵敏。     图：相比于传统的蛋白标志物CA15-3，ctDNA和CTC的变化更加灵敏。   克服肿瘤异质性   肿瘤在生长过程中，经过多次分裂增殖，其子细胞呈现出分子生物学或基因方面的改变，从而使肿瘤内出现不同的亚克隆，亚克隆间生长速度、侵袭能力、对药物的敏感性、预后等各方面都存在差异。而对于癌细胞已经发生转移的患者而言，不同病灶间的差异会更加明显。   图：肿瘤的异质性。我们必须认识到，肿瘤组织并不是单纯、均一的。如同一个社会中存在各式各样的人，肿瘤组织中也存在各式各样的亚克隆。   这种异质性会导致组织活检出现假阴性，而血液是全身循环的，能够更全面地获取肿瘤信息。如果检测技术灵敏度足够高，液体活检能够达到比组织更高的敏感性，例如Lanman RB等就通过上千例样本检测发现，ctDNA检测敏感性85.0%，高于组织活检的80.7%。如果结合组织活检和液体活检，则可进一步提高阳性率，使更多患者获益。   所以，液体活检绝不仅仅是组织活检无法进行时的替代品，而是能够将基因检测引入肿瘤早期筛查和动态监测的革命性技术！在指导个体化用药方面液体活检也能以其全面、灵活和无创的特点，成为组织活检的良好补充。   往期回顾 […]

海普洛斯推出【液体活检口袋书】专栏，对液体活检进行系统、全面的介绍。 第1期，我们将对液体活检进行概括性的介绍，期望能使您对液体活检有大体的印象。   ▼ 图：卢煜明。堪称液体活检的开山鼻祖。     从煮方便面中得到的灵感   提到液体活检，让我们从它的发现历程说起。上图这位香港中文大学的教授在2016年不仅获诺贝尔生理学或医学奖提名，更成为了被称为“中国诺贝尔奖”的未来科学大奖首届得奖者。他叫卢煜明(Dennis Lo)，被誉为“无创产检之父”。   卢煜明早年在牛津大学做医学生时，知道孕妇要做很多检查，其中一项就是抽胎儿羊水做监测。这项手术有0.5%的流产风险。他当时就想有没有办法从孕妇的血液中找到胎儿的细胞，这样就免去抽羊水存在的风险。1997年，在英国学习、生活了13年的卢煜明回到中国香港，正式开始NIPT技术的研究。偶然地，他从煮方便面的时候获取灵感，把血浆煮沸后，在孕妇血液中找到胎儿DNA，从而发明了无创DNA产前诊断（Non-Invasive Prenatal Testing, NIPT），孕妇产检时不必再使用风险较大的羊水穿刺技术。   图：无创产检。抽母亲的血，查孩子的DNA。   在“煮面”发现DNA后，卢煜明的想法应接不暇，他设想将来把胎儿和癌症的检测进行 “嫁接”。这是从他收治的一个案例得到的启发。   一名孕妇想通过NIPT技术看自己的胎儿是否健康。在检查她的血液后，发现有很多不正常的染色体不是源于胎儿，而是淋巴细胞。最后发现这个孕妇其实患有淋巴癌。在经过一段时间治疗后，血浆检查不再发现这个信号。   “为什么不通过检测血液中癌细胞DNA的含量、动态变化及其他特质来诊断是否癌症呢？”在相同的理论支持下，他当时就决定把癌症和胎儿研究同时做。这一技术，现在被称为“癌症的液体活检”。   液体活检是一门体外诊断技术   液体活检（liquid biopsy），作为体外诊断的一个分支，液体活检就是通过血液或者尿液等体液对癌症等疾病做出分析诊断。目前液体活检主要应用领域是肿瘤的血液检测，即利用血液提示肿瘤发展进程及抗药性等信息，指导个体化精准治疗。与现有肿瘤检测方法相比，液体活检无侵入性、可频繁多次检测及快速反应能力均体现出显着的优势，应用发展潜力巨大。   图：经皮肺组织活检。具有一定风险，需要由经验丰富的医生操作，患者会承受一定的痛苦。     图：液体活检。无痛苦，可重复取样，实时监测疾病动态。   潜力巨大的新兴市场   JP 摩根将液体活检分为早期筛查、诊断分型、药物伴随检测、患者病情检测4 个细分领域，预计全球市场潜力为230 亿美元；高盛也将液体活检应用分为4 个领域，预计其在美国的市场潜力可达到140 亿美元，并预测该市场需要5-15 年才能完全成熟。液体活检领域的专家卢煜明也表示“癌症液体活检未来市场约400 亿美元。根据公开资料上不同机构的预测，我们可以看到，未来液体活检将有百亿美元的市场空间，其中肿瘤的早期筛查占比最大。”     图：液体活检是一个新兴市场，具有巨大的市场潜力。   液体活检克服了组织活检的局限性   液体活检之所以受到越来越大的重视，是因为科学家发现在癌症的诊断和治疗过程中组织活检技术有一定的局限性。主要表现为：肿瘤具有异质性，对于癌细胞已经发生转移的患者而言，仅仅取某个部位的肿瘤组织，并不能反映患者的整体情况，但对所有的肿瘤组织都取样检测又不切实际；某些患者自身的情况决定了他不适合做组织活检；受到手术的扰动之后，有些肿瘤有加速转移的风险；组织活检的滞后性对患者的治疗也是不利的。   图：人们往往以为，肿瘤细胞就像是左边机器中的白球，稳定，均一。实际上肿瘤细胞具备高度异质性（多样性），这就意味着一次组织活检能获得的一小部分肿瘤细胞不能代表整个肿瘤的情况，就像从右边的机器随机喷出的球一样。液态活检克服了这个问题。   而液体活检技术的出现，在理论上能够解决了上述问题，能够更全面、更便捷地进行肿瘤检测，而且可以实现动态监测和早期筛查。这也是液体活检技术被《麻省理工大学科技评论》评选为“2015年十大突破技术”的原因。   图：以肺癌为例，液体活检能实现的目标有至少5个：复发监测，治疗效果监测，个性化治疗，靶向治疗用药指导，发现新的治疗靶点。   液体活检，检的是什么？   液体活检主要检测物包括检测血液中游离的以下物质： […]

海普洛斯推出【液体活检口袋书】专栏，对液体活检进行系统、全面的介绍。 第4期，我们将对ctDNA的发展史进行介绍，期望使您理解ctDNA在液体活检中占据重要地位的原因。 ▼ ctDNA作为现在液体活检最重要的标志物，从其发现到进入临床应用都经历了哪些过程呢？今天就跟大家分享一下ctDNA研究和应用的历史。 首先为大家展现一个timeline，简要地囊括了ctDNA发展史上的重要事件。 1948年 Mandel和Metais发现血浆中存在游离的核酸分子。 1977年 Leon等人发现，肿瘤患者的血浆游离DNA水平要明显高于健康人群，据此推测游离DNA与肿瘤相关。 1989年 Stroun和colleagues报道肿瘤患者的cfDNA中部分来源于肿瘤细胞。 1994年 第一次利用PCR方法在胰腺癌患者血液cfDNA中检测到了KRAS突变，该突变与肿瘤组织中检测到的一致。 2008年 Diehl F.等对18名肠癌患者的ctDNA进行了跟踪，利用BEAMing技术检测APC、KRAS、TP53、PIK3CA等基因热点突变，发现ctDNA突变率随着治疗过程变化，变化趋势与肿瘤负荷及CEA浓度呈正相关。 2012年 Forshew T等人与Michael W等人分别发表文章，利用分子标签的原理过滤NGS中的PCR错误和测序错误，能够显著降低背景噪音，从而提高NGS检测灵敏度，使之适用于cfDNA中超低频突变的检测。 2014年 欧盟EMA批准利用ctDNA检测EGFR突变用于易瑞沙的伴随诊断，标志着ctDNA正式临床应用。 2015年 《非小细胞肺癌(NSCLC)血液EGFR基因突变检测中国专家共识》于《中华医学杂志》上发表，补充了如果肿瘤标本不可评估EGFR基因状态，则可使用从血液(血浆)标本中获得的ctDNA进行评估。 2016年 非小细胞肺癌NCCN指南中添加了液体活检推荐。 通过这条时间线我们可以看到，ctDNA有着数十年的历史。接下来就为大家详细解说，它是如何从孟德尔的发现一路走进NCCN指南的。 cfDNA的发现 血中游离DNA简称cfDNA（Cell-Free DNA），是指循环血中游离于细胞外的部分降解了的机体内源性DNA。 早在1948年，比DNA双螺旋结构发现还早6年的时候，Mandel和Metais就发现血浆中存在游离的核酸分子；1977年，Leon等人发现，肿瘤患者的血浆游离DNA水平要明显高于健康人群，据此推测游离DNA与肿瘤相关。但由于缺乏高灵敏性和高特异性的实验方法，导致有关血中游离DNA与疾病相关性的研究在较长时期内进展缓慢。直到有效分离游离DNA技术的出现，和特殊荧光染料与PCR技术相结合的检测技术的应用，才使这一领域的研究得到了较迅速发展。 ctDNA作为肿瘤标志物地位的确立 1989年，Stroun和colleagues报道肿瘤患者的cfDNA中部分来源于肿瘤细胞；1991年, Sidransky等人研究表明，膀胱癌患者尿沉渣中DNA携带有TP53突变，提示了可以利用基因分析来检测cfDNA；之后陆续在结直肠癌、胰腺癌及肺癌等患者的粪便和痰样本中检测到了KRAS突变。1994年, 第一次利用PCR方法在胰腺癌患者血液cfDNA中检测到了KRAS突变，该突变与肿瘤组织中检测到的一致。也就是说，cfDNA中携带肿瘤特有突变的那一小部分DNA，确确实实是由肿瘤细胞释放出来的。 此后，人们认识到cfDNA中的肿瘤相关突变是肿瘤特异性的标志物，并称这些携带肿瘤特征的cfDNA片段为循环肿瘤DNA（Circulating Tumor DNA，ctDNA）。 技术革新促进ctDNA研究爆发 测序技术限制着ctDNA的研究发展。直到2000年前后，高灵敏度技术开始出现，ctDNA的研究开始爆发。 随着更高灵敏度的数字PCR（digital PCR，dPCR于1999年出现）和BEAMing技术（于2006年出现）的应用，ctDNA的研究逐渐增多。2008年，Diehl F.等对18名肠癌患者的ctDNA进行了跟踪，利用BEAMing技术检测APC、KRAS、TP53、PIK3CA等基因热点突变，发现ctDNA突变率随着治疗过程变化，变化趋势与肿瘤负荷及CEA浓度呈正相关。 然而，dPCR和BEAMing虽然检测灵敏度高达0.01%，但其检测范围仅局限于少许位点，往往需要先对肿瘤组织进行测序挑选特定位点，再进行后续监测，严重限制了ctDNA研究的广度。 单分子编码技术的建立是ctDNA发展史上的一个里程碑。 2012 年，Forshew T等人与Michael W等人分别发表文章，利用分子标签的原理过滤NGS中的PCR错误和测序错误，能够显著降低背景噪音，从而提高NGS检测灵敏度，使之适用于cfDNA中超低频突变的检测（关于这一技术我们会在下一期详细说明）。从此，基于分子标签原理的NGS检测成为ctDNA研究最强大的工具。由于NGS检测范围广的特点，拓展了ctDNA的应用场景，使之可以不局限于特定位点突变频率的检测，还可以进行数十上百个基因的广泛筛查，从而可以应用于药物靶点检测、耐药机制分析、早期肿瘤筛查等方向，ctDNA研究也迎来了爆发期。 2016年ASCO上，美国Guardant Health发布了史上最大规模的ctDNA检测研究结果，其Guardant360平台检测了15191例病人的17628份血液标本和398位病人的组织标本，结果发现，在83%病人的血液中能够检测到ctDNA，血检结果对肿瘤的诊断准确率可高达87% （336/386），若血液检查和组织活检相差六个月内，血检和活检的一致性可高达98%。 ctDNA逐渐走入临床应用 “若组织活检不可重复实行，应考虑进行血浆活检。”——NCCN指南，2017年第4版，非小细胞肺癌。 随着ctDNA研究的逐渐成熟，利用ctDNA进行临床检测也逐渐受到了认可。2014年9月，欧盟EMA批准利用ctDNA检测EGFR突变用于易瑞沙的伴随诊断，标志着ctDNA正式临床应用。2015年12月，《非小细胞肺癌(NSCLC)血液EGFR基因突变检测中国专家共识》于《中华医学杂志》上发表，补充了如果肿瘤标本不可评估EGFR基因状态，则可使用从血液(血浆)标本中获得的ctDNA进行评估。2016年6月，美国FDA批准罗氏cobas […]

最近，液体活检十分被看好，从美国癌症早筛公司Grail宣布9亿美元B轮融资落地，到国际顶尖期刊的研究报道，无论是市场还是科研，均给液体活检的发展带来了好消息。   近日，张鹍教授团队在《NatureGenetics》上发布最新力作——世界首创高通量甲基化无创检测新技术，未来可以用于癌症无创早筛与溯源。该技术利用癌症标记物和组织特异性CpG甲基化模式的双重信号来检测和定位癌症。   此外，Nature上最近刊发了多篇关于液体活检的综述，描述了液体活检在肿瘤领域的应用现状，认为基于ctDNA的液体活检应用前景十分宽广。     1. 液体活检到了成年期   2017年2月22日《NATURE REVIEWS CANCER》发表了一篇题为《液体活检到了成年期：迈向循环肿瘤DNA》的综述（Liquid biopsies come of age: towards implementation of circulating tumour DNA）。该综述通过结合将近250篇已有文献，认为当前是十分令人兴奋的过渡时期，因为ctDNA已经开始应用于临床，尽管游离DNA生物学还有很多尚未解开的谜团。当前也是评价ctDNA分析方法的适当时期，是时候考虑将其应用到肿瘤个性化研究中。   如今临床上紧迫需要新的肿瘤分子诊断工具。传统的抽样方法如穿刺活组织切片除了具有创伤性，还难以获得足够多且高质量的样本用于基因组分析，并且还可能因为遗传异质性而导致采样偏见。疾病的检测和监测往往依赖于体内的流体标记物，而成像检测往往会使患者暴露于电离辐射中，并且这种方法无论在时间还是在空间上的分辨率都是有限的。   ctDNA的近期研成果突出了其在疾病管理各个阶段中的应用潜力，主要包括通过分析ctDNA来量化疾病负担以及分析癌症基因组。基因组学和分子生物学技术的发展扩大了ctDNA潜在的应用范围，包括在研究以及癌症管理上的应用。   理论研究也已经证实了ctDNA在疾病预测、分子分析以及疾病监测上的潜力。PCR技术和高通量测序技术的可用性及可靠性的提高，促进对新型高灵敏度ctDNA的应用力度，同时还生成大量的临床数据集，帮助人们更好地理解cfDNA和ctDNA的起源。     2. 将液体活检整合到癌症管理中   2017年3月2日，《Nature Reviews Clinical Oncology》杂志也发表了一篇液体活检综述，题为《将液体活检整合到癌症管理中》《Integrating liquid biopsies into the management of cancer》。除了血液，其他体液如尿液、唾液、胸腔积液、脑脊液也包含肿瘤衍生的遗传信息。该综述研究了如何使用不同形式的液体活检来指导临床护理，以及最终如何将它们纳入到临床实践中。ctDNA中的分子信息可以进一步补充CTCs（循环肿瘤细胞）、RNA、蛋白质以及外泌体所提供的信息，基于ctDNA的液体活检也是本综述强调的重点。   在癌症发展和治疗过程中，肿瘤细胞的多个亚群体相互竞争，选择压力促进了主导亚克隆的形成，它们是复制以及传播最为熟练的群体，也最不容易治疗。目前手术或组织活检是分析实体肿瘤分子剖面的主要手段，然而这种方法受抽样偏差，仅仅能提高肿瘤异质性的“快照”，并且样本不能重复获取。ctDNA已被证明与肿瘤实时变化密切相关，对分子病理学和临床肿瘤学具有重要的影响，可用来评估耐药性、监测治疗反应以及量化微小残留病灶。   目前，液体活检主要以ctDNA、CTC及外泌体作为肿瘤诊断的生物标志物，那么这三者在具体应用中到底有什么区别呢？我们来看看下表。     本表格翻译自综述原文，表中“Yes”表示方法可行，或者有研究可参考；“No”表示方法不可行或者没有研究可参考。     3. 液体活检已经走进临床应用   Nature上的综述通过分析大量文献，认为液体活检在临床肿瘤学中十分具有应用潜力，尤其是基于ctDNA的液体活检。近年来，基于ctDNA的疾病诊断以及预后判断取得了显著的研究成果，ctDNA检测也成为了实现肿瘤精准治疗最为有力的技术之一，其在肿瘤早期筛查研究中的应用也开始普遍起来。 […]