CAR-T在胃癌免疫治疗中的研究进展

胃癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，也是全球第三大最常见的癌症死亡原因，据2020年全球相关数据统计，新增胃癌病例超过100万例（约占所有癌症诊断人数的6%），新增死亡人数约76.8万例（约占所有癌症死亡人数的8.2%），在世界范围内成为较大的健康负担。传统的治疗方法，如手术，仅适用于早期胃癌，但这种疾病诊断时往往已是晚期，治疗选择有限，而且大多数患者对这些药物并不特别敏感，这强调了发现新的治疗模式的紧迫性。

嵌合抗原受体T细胞免疫（CAR-T）疗法是细胞过继治疗（ACT）的方法之一，其主要原理是从患者身上分离T细胞，利用基因工程技术为T细胞插入一个能够识别肿瘤细胞并同时激活T细胞的嵌合抗原受体（CAR），然后将扩增好的CAR-T细胞回输到患者体内并攻击表达相关抗原的目标细胞，而不依赖于主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）限制。作为一种活性药物，CAR-T细胞免疫治疗正迅速成为一种有前途的治疗血液和非血液系统恶性肿瘤的创新治疗策略。2017年，美国食品与药品监督管理局（FDA）批准诺华公司的CAR-T细胞治疗产品Kymriah 上市，用于治疗难治或至少接受二线方案治疗后复发的25岁以下B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）患者，是人类历史上批准的首款CAR-T细胞产品，被FDA授予“突破性治疗”称号。

在血液系统恶性肿瘤领域取得初步成功后，CAR-T细胞治疗现在被广泛研究用于治疗实体恶性肿瘤的难治性和复发病例，许多研究表明，CAR-T细胞疗法在胃癌中取得了重大进展，本综述将系统介绍CAR-T疗法在胃癌中的最新研究进展，包括CAR-T的生物学基础、临床应用、所面临的挑战及应对策略。

一、CAR-T治疗原理

T细胞要识别不同的细胞，需依靠T细胞表面的T细胞受体（T-cell receptor，TCR）与细胞表面的MHC分子递呈的抗原相结合，才能发挥识别作用。而肿瘤细胞可通过调低或者丢失MHC的表达以逃脱T细胞对它的识别和杀伤作用。细胞过继治疗方法如肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）疗法和T细胞受体工程化T细胞（TCR-T）疗法，均仅能识别MHC提呈的抗原，可能因肿瘤细胞下调或突变其MHC分子而逃避免疫监视，临床上有一定局限性。为了避开MHC的限制作用，一个极具前景的方法就是对T细胞进行改造，利用CAR对T细胞进行修饰，使T细胞获得针对某个靶点抗原表位的特异性，从而增强T细胞识别抗原信号与活化的功能，相较于天然T细胞表面受体，CAR赋予T细胞人淋巴细胞抗原（HLA）非依赖性方式识别肿瘤抗原的能力，具有传统细胞过继疗法无法比拟的优势。目前，CAR-T细胞疗法药物被批用于治疗B细胞白血病和淋巴瘤以及多发性骨髓瘤。

二、CAR-T治疗过程及检测技术

CAR-T治疗过程可以分为不同的步骤：

1）医师从患者体内提取血液。

2）将提取的血液分离出非特异性的T细胞，在体外常使用病毒载体转导技术或基因组编辑技术，在T细胞表面插入可特异性识别肿瘤抗原的CAR。

3）经过一定程度的扩增后产生的T淋巴细胞，随即再回输回患者体内以对抗肿瘤细胞。

尽管这种自体CAR-T细胞不会引起排斥反应，但它也有一些众所周知的缺点如高昂的费用成本（约35～40万美元）和制备时间较长（约2～3周），且多数患者在接受CAR-T细胞治疗前均需使用放疗或者化疗进行淋巴耗竭预处理，这可能导致自体CAR-T细胞的生产效率低下甚至制备失败。

“现货型”（off-the-shelf）CAR-T细胞是指同种异体来源的T细胞制备而成的CAR-T细胞，其制备过程分为以下步骤：

1）从健康供体内分离出T淋巴细胞。

2）通过病毒载体将CAR基因转导入T细胞中并进行T细胞扩增。

3）经严格质检、分装、冷冻储存后，理论上可以如同“药品”一般，随时可供患者使用，无需等待。

同种异体CAR-T细胞治疗有许多潜在的优势，例如由于工业化和规模化的实施而降低了成本，生产成批的低温保存的T细胞，使患者可以立即获得治疗。但现货型”CAR-T细胞存在2个问题：

1）可能危及患者生命的移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GvHD），为避免GvHD的发生，制备“现货型”CAR-T细胞应利用基因编辑技术敲除会引起GvHD和免疫系统排斥的相关基因（如HLA等）；

2）异体T细胞可能被宿主免疫系统迅速清除，为增加T细胞持久性可通过基因编辑给予更多的共刺激信号，延长T淋巴细胞的持续时间，而不影响CAR-T细胞活性。

CAR的结构和演化的示意图

CAR-T治疗效果若要得到保障，高效的检测技术必不可少。流式细胞术（flow cytometry，FCM）是一种能够对单个细胞或生物微颗粒生物学性质进行定量分析和分选的检测手段，在整个生产、治疗过程中监控CAR-T细胞群体组成，并评估体内细胞的持久性和治疗效果发挥重要作用。如制备过程中，FCM可分析患者分离血液的成分，筛选与预后更好的供体T细胞特定群体以及评估CAR-T细胞的表型和功能，Fraietta等对自体来源CAR-T细胞进行基因组、表型和功能评估，发现CD27+CD45RO-CD8+T细胞的比例增高，与抗CD19CAR-T细胞治疗慢性淋巴细胞白血病患者的持续缓解有关。Salem等采用FCM和免疫组织化学（IHC）检测多发性骨髓瘤肿瘤细胞中BCMA表达的发生率和强度。FCM检测的阳性率显著高于IHC检测（97% vs. 72%，P<0.01）。值得注意的是，目的抗原的表达百分比和强度可能受到是否进行IHC或FCM、使用的抗体克隆、偶联荧光团或染料以及仪器设置和校准的影响。

三、CAR-T治疗在胃癌中的应用

晚期胃癌生存期短，治疗效果不理想，迫切需要新的治疗方法。目前，全球范围内针对胃癌的CAR-T细胞治疗研究已取得了一些进展，发现了一些胃癌的肿瘤标志物，现依据靶点对CAR-T细胞进行分类介绍。

1. HER-2

人表皮生长因子受体2（HER-2）是具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜蛋白，属于EGFR家族成员之一，其高表达可启动多种信号通路导致细胞增殖和肿瘤发生。正常人体组织中其表达量极低，HER-2在多种恶性肿瘤中过表达，并可作为肿瘤预后的评估指标。在胃癌中，10%～20%的确诊病例中HER-2过表达。

曲妥珠单抗（赫赛汀）是一种靶向HER-2的单克隆抗体，并常联合化疗治疗HER-2阳性胃癌，但在治疗约1年后通常出现耐药导致治疗失败，因此，采用新的更有效的治疗方法是必要的。Han等将共刺激因子CD137加入到HER-2CAR-T细胞中构建的chA21-4-1BBz CAR-T细胞，可在体外特异性地消除HER-2细胞，在体内研究中能够抑制皮下移植肿瘤模型和腹膜转移模型中HER-2的过表达。Song等将CD137-anti-HER-2 ScFv CAR通过慢病毒载体转染到T细胞中，能有效杀伤HER-2阳性胃癌细胞系和患者来源的原代胃癌细胞，还可以有效抑制胃癌干细胞的生长。Luo等设计一种双特异性T细胞激动剂 （bispecific T-cell engagers，BiTEs），由两个ScFv组成，可同时靶向TCR的CD3分子和肿瘤表面抗原HER-2，使T细胞和癌细胞之间形成免疫突触，从而介导肿瘤细胞死亡，这表明HER-2靶向CAR-T细胞治疗是治疗HER-2阳性进展期胃癌的潜在治疗策略，但其毒性仍需验证。

2. EpCAM

上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）是一种表达于部分正常上皮细胞和多数恶性上皮肿瘤细胞表面的糖蛋白，EpCAM在细胞信号转导、分化、迁移和增殖中发挥重要作用，其过表达与患者预后不良相关。EpCAM在超过90%的胃癌中过表达，这使得这种蛋白有潜力成为CAR-T细胞治疗的理想靶点。靶向EpCAM的CAR-T细胞治疗正在胃癌患者中进行研究，2015年的Ⅰ/Ⅱ期临床试验NCT02725125，旨在评估EpCAM CAR-T细胞治疗复发或难治性EpCAM阳性胃癌患者的疗效及安全性。2018年的临床试验NCT03563326，旨在比较EpCAM CAR-T与常规化疗两种疗法对EpCAM阳性且有腹膜转移的晚期胃癌患者的有效性和安全性。

3. CEA

癌胚抗原（CEA）是一种肿瘤相关抗原，最初认为是一种存在于结肠癌、正常胚胎肠道的蛋白多糖复合物，后被证实可广泛存在于内胚层起源的消化系统肿瘤，如结直肠癌、胃癌和胰腺癌等，其表达量与肿瘤的恶性程度正相关，在正常人血清中也可有微量存在，因此针对CEA的CAR-T治疗需考虑其可能不良反应。Wang等针对CEA特异性CAR-T细胞治疗的研究表明，使用CAR-T细胞治疗有助于延长晚期胃癌小鼠的生存时间，并减缓肿瘤生长。Shibaguchi等将IL-2基因插入到CAR结构中，使CAR-T能够自分泌细胞因子IL-2，增强了其对人胃癌细胞系MKN-45的杀伤作用。Chi等将CEA特异性CAR-T与重组人IL-12（rhIL-12）联合应用，体外实验证实rhIL-12显著增加CEACAR-T细胞的活化、增殖和细胞毒性，在体内实验中发现联合应用对胃癌细胞系MGC803的生长抑制作用明显强于单用CEACAR-T细胞，因此，需要开发一种利用细胞因子增强CEA CAR-T治疗效果的策略。此外，2014年开展的临床试验NCT02349724，主要目的是验证CEA CAR-T细胞的安全性，并确定注射CAR-T细胞的适当剂量。

4. CLDN18.2

细胞紧密连接蛋白18.2（claudin18.2，CLDN18.2）是claudins蛋白的一种剪接体，主要在上皮细胞中表达，其功能主要是调节屏障结构的渗透性。CLDN18.2在70%的原发性胃腺癌及其转移灶中过表达，在胰腺、食管和肺肿瘤中也存在表达，因此特异性地抑制CLDN18.2被认为是治疗晚期或者转移性胃癌的一个有效途径。Jiang等设计了优化抗体hu8E5-2I-28z（28z: CD28CD3ζ）并构建CLDN18.2 CAR-T细胞，能够有效抑制人源性肿瘤异种移植（PDX）肿瘤模型的生长，且CLDN18.2CAR-T具有较好的安全性，对小鼠的胃和其他器官未造成明显的不良反应。2019年，Zhan等发表的一项Ⅰ期临床试验NCT03159819结果显示，应用CLDN18.2 CAR-T治疗进展期胃癌和胰腺癌患者，总客观缓解率为33%，且无严重不良反应。2020年开展的一项多中心Ⅰb期临床试验NCT04404595，旨在评估自体CLDN18.2CAR-T细胞治疗进展期胃或胰腺腺癌患者的安全性和有效性。

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2022年5月9日，北京大学肿瘤医院沈琳教授团队在国际权威学术期刊《Nature Medicine》在线发表题为“Claudin18.2-specific CAR T cells in gastrointestinal cancers: phase 1 trial interim results”论文。该研究探索了靶向Claudin18.2 CAR-T在消化系统肿瘤中的疗效和安全性，是第一个针对Claudin18.2靶点的细胞免疫治疗系统性的I期临床研究，是CAR-T细胞治疗实体瘤的突破性进展，亦对后续CAR-T细胞治疗实体瘤研究具有很高的借鉴价值。

（点击图片，转到该研究详细报道）

5. MUC1

黏蛋白（MUC1）是一种高度糖基化的跨膜蛋白，在多种器官（胃肠、眼及肺等）的上皮表面形成黏膜屏障，起着重要的保护作用。同时，MUC1在细胞信号传导以及肿瘤发生的所有阶段均起着重要作用，其过表达与包括胃癌在内的多种肿瘤有关，且高表达往往提示预后不良，被广泛用于监测肿瘤进展和转移情况。此外，肿瘤组织和正常组织的MUC1不仅在表达量上有差异，肿瘤与正常组织的MUC1糖基化也存在差异，这也是开发区分肿瘤特异性药物的生物学基础。Wilkie等设计了一种包含CD28/OX40/CD3-ζ结构域的CAR（HOX），并诱导促炎细胞因子IFN-γ和IL-17的产生，对MUC1阳性肿瘤细胞显示出杀伤作用。2015年的一项Ⅰ/Ⅱ期临床试验NCT02617134，旨在评价MUC1CAR-T在MUC1阳性的复发或难治性胃癌等实体瘤患者中的有效性和安全性。

6. MSLN

间皮素（mesothelin，MSLN）是一种40-kDa的膜蛋白，通过磷脂酰肌醇附着在细胞表面，正常在胸膜、心包和腹膜的间皮细胞中低表达，高表达于多种肿瘤组织中，如间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌和胃癌等，MSLN的异常表达通过激活PI3K、ERK和MAPK信号通路在癌细胞增殖、侵袭和转移中起核心作用。Lv等设计了包含ScFv及CD28、CD3ζ、DAP10胞内信号域的靶向MSLN的第三代CAR-T细胞（M28z10 T），在体内尾静脉模型和腹腔模型等多个模型表明，M28z10T细胞能够明显抑制胃癌的生长，甚至在部分小鼠体内达到完全清除肿瘤的效果，同时还发现相比静脉注射，癌旁或瘤内注射等局部注射方式可能会有效地提高治疗效果。Zhang等使用改良的piggyBac转座子系统构建了anti-meso1（膜远端区域）-scFv和anti-meso3（膜近端区域）-scFv与28z连接的第二代CAR-T，发现靶向膜近端区域的anti-meso3-scFvCAR-T分泌更多的细胞因子，介导的杀伤肿瘤反应更强，对HGC-27皮下胃癌模型具有良好的抗肿瘤活性。2019年的一项多靶点CAR-T细胞治疗多种肿瘤的临床试验NCT03941626，其中包括评估MSLN CAR-T细胞治疗胃癌的疗效和安全性。

7. FOLR1

叶酸受体1（folate receptor 1，FOLR1），又称叶酸受体α和叶酸结合蛋白，是一种糖基磷脂酰肌醇连接蛋白，FOLR1对叶酸有很高的亲和力，在与叶酸结合时启动细胞内调节信号，与叶酸结合的FOLR1被内化进入细胞核，作为转录因子参与细胞增殖活化。FOLR1在多种恶性肿瘤中过表达，包括卵巢癌、乳腺癌、肾癌和肺癌等，超过1/3的胃癌患者肿瘤细胞表面过表达FOLR1，但在正常组织中很少表达，这使得FOLR1成为CAR-T细胞治疗的潜在靶点。Kim等构建了包含CD28和CD3ζ信号域的第二代CAR-T细胞，对FOLR1阳性的胃癌细胞系表现出强大的杀伤作用，研究还发现当FOLR1CAR-T细胞与FOLR1阳性胃癌细胞共培养时，人T细胞中的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和颗粒酶B增加，颗粒酶B在细胞毒性中起重要作用。

8. NKG2D

自然杀伤细胞家族2成员D（NKG2D）常表达于自然杀伤（natural killer，NK）细胞表面，通过与靶细胞表面配体（NKG2D-ligand，NKG2DL）相结合，介导细胞毒效应以发挥杀伤作用。NKG2DL在正常细胞表面不表达或较低水平表达，然而当机体出现病原体感染、氧化或应激、药物、组织损伤、增殖和恶性细胞转化等情况，NKG2DL将在细胞表面诱导性表达，免疫组织化学发现NKG2DL在胃癌中广泛表达，且NKG2DL的表达使得胃癌细胞容易被NK细胞识别、杀伤。Liu等设计了NKG2D-CD28-CD3ζ CAR-T细胞，这种CAR-T细胞能够杀伤表达NKG2DL的胃癌细胞系MKN-28和MKN-74和腹水来源的原发人胃癌细胞。Tao等类似地也构建针对NKG2D的第二代CAR-T细胞，在体内外显示出强大的抗胃癌的细胞溶解活性，此外研究还发现顺铂还可以上调胃癌细胞中NKG2D配体的表达，增强对NKG2D CAR-T细胞介导的细胞毒性的敏感性。Landmark Medical Center牵头的Ⅰ期临床研究NCT04107142，评估NKG2D CAR-T细胞治疗包含胃癌在内的复发或难治性实体肿瘤患者的安全性和耐受性。

9. Trop2

人滋养层细胞表面抗原2（Trop2）首次在人滋养细胞和绒癌细胞系中发现，主要表达在上皮细胞膜表面，是一种36-kDa的单跨膜蛋白。Trop2在胃癌中高表达，且通常提示预后较差，因此可以作为胃癌的新靶点。Zhao等制备了一种双特异性的Trop2/PD-L1 CAR-T细胞，该细胞能够特异性靶向Trop2和PD-L1肿瘤抗原，并能够阻断PD-1/PD-L1信号通路，且双特异性CAR-T细胞在体内和体外均对胃癌细胞显示出杀伤作用。

10. MG7-AG

胃癌单克隆抗体（MG7-Ag）是一种中性糖脂类TTA，其在正常胃黏膜中不表达或低表达，而在早期胃癌中的特异性高表达让其有可能成为早期胃癌诊断的预警因子。Yuan等设计的MG7CAR-T细胞用于治疗胃癌PDX模型的结果显示，100%小鼠见到肿瘤缩小，其中60%小鼠达到肿瘤的完全消除，且在治疗1年后仍未看到肿瘤的复发，外周血中仍可检测到1年前回输的MG7 CAR-T细胞。

四、CAR-T在实体瘤治疗中的挑战

尽管CAR-T细胞已在胃癌等实体瘤治疗中取得了初步疗效，但其治疗效果与血液系统肿瘤相比还存在着差距，面临更多挑战。

1. 肿瘤微环境

肿瘤微环境（TME）是一种癌细胞重新设计以促进其生长的微环境，由肿瘤细胞、炎症细胞、成纤维细胞、间质组织及各种细胞因子等组成。对血液系统肿瘤而言，进入血液循环的CAR-T细胞便到达目的地，而对于实体肿瘤而言，肿瘤微环境不仅具有物理屏障抑制T细胞的浸润，而且肿瘤微环境中还包含多种免疫抑制细胞（M2型巨噬细胞、调节性T细胞等）和免疫检查点（程序性细胞死亡受体1、细胞毒性 T 淋巴细胞相关蛋白4等），通过多种途径抑制CAR-T 细胞发挥杀伤活性。此外，实体肿瘤肿瘤微环境中低pH、低氧和营养不良均不利于CAR-T细胞的存活和激活。

为克服这一难题，将CAR-T有效运输至肿瘤部位，可在CAR-T细胞中添加趋化因子来增加其向肿瘤部位的募集，或改善肿瘤周围的细胞、组织及血供等来增加CAR-T细胞在肿瘤部位的浸润；为改善因肿瘤微环境引起的免疫抑制作用，有研究设计了连接抗PD-L1 ScFv序列的CAR-T细胞，这种CAR-T细胞在杀灭胃癌肿瘤细胞的同时还阻断PD-1/PD-L1信号通路以解除免疫抑制状态。

2. 靶点的特异性

CAR-T细胞治疗的前提是靶抗原的选择，但与血液系统肿瘤相比，在实体瘤中找到理想的靶抗原更加困难。血液系统肿瘤如急性淋巴细胞白血病或慢性淋巴细胞白血病，普遍表达B细胞标志物CD19，但实体瘤很少表达一种TSA。另一方面，本文提到的部分靶抗原如EpCAM、CEA等均为TAA，CAR-T 细胞在清除肿瘤细胞的同时，也有可能错误地攻击正常组织细胞，即所谓的“脱靶现象”，使得CAR-T细胞疗法不能得到预期的治疗效果。

针对这一问题，有研究为CAR串联双特异性靶抗原，只有当CAR与所有抗原同时结合时才能充分活化发挥杀伤作用。还可利用低氧诱导因子1α降解途径来限制，只有CAR-T细胞位于肿瘤低氧微环境时才表达CAR，从而减少对非恶性组织的负面影响（非恶性组织主要是非低氧状态）。最近，美国约翰霍普金斯大学医学院的研究人员开发了一种靶向LOH（杂合性缺失）的新型癌症免疫疗法NASCAR，即肿瘤靶向等位基因特异性CAR（neoplasm-targeting allele-sensing CAR），LOH是恶性肿瘤中常见的一种基因突变，LOH的发生有助于将癌细胞与正常细胞区分开。该疗法旨在将癌细胞中等位基因的缺失事件转化为免疫细胞的激活信号，实现对肿瘤的杀伤，减少对正常细胞的损伤。

3. CAR-T细胞的持久性

2017年于美国上市的两款靶向CD19的CAR-T细胞产品，在治疗B-ALL和弥漫性大B细胞淋巴瘤方面表现出出色的疗效，但研究发现约30%～50%接受CD19 CAR-T疗法的患者在达到缓解之后癌症会再度复发，大多数复发出现在接受治疗后1年内，这通常是由于CAR-T细胞持久性有限和/或B细胞发育不全。且复发并不限于靶向CD19的疗法，CAR-T细胞在实体肿瘤中的增殖存活情况也并不乐观观。

为提高CAR-T抗肿瘤持久性、预防肿瘤复发，有研究设计了结合可诱导共刺激因子ICOS和4-1BB的第三代CAR-T细胞，在实体肿瘤模型中显示出了较为显著的抗肿瘤作用和增强的体内持久性。此外，另有研究对CAR-T细胞进行改造，使其过表达硫氧还蛋白1（thioredoxin-1，Trx1），以适应TME中营养物质和氧减少的条件，实验结果显示T细胞的寿命明显延长、细胞活力也相应增强，同时研究还发现Trx1的抗氧化作用可降低供体T细胞中的毒性活性氧，使其对患者健康组织的反应性降低，从而阻止GvHD的发展。

4. 不良反应

CAR-T细胞治疗展现出显著疗效的同时，也伴随着多种不良反应，其中最常见且最严重的是细胞因子释放综合征/细胞因子风暴（cytokine storm，CRS），当大量有活性的CAR-T回输入体内，会释放大量促炎性细胞因子，如IL-6、IFN-γ、TFN-α等，从而引起高烧、低血压、多器官功能衰竭等临床表现。除CRS外，另一常见不良反应为CAR-T细胞相关脑病综合征，可表现为语言障碍、手写障碍和定向力障碍等，若发生脑水肿则属于最严重的神经毒性并发症。值得注意的是，一项国内开展的CLDN18.2 CAR-T（CT041）治疗12例转移性腺癌（胃腺癌7例）的临床试验结果显示，所有患者均未发生严重不良事件，包括治疗相关死亡或严重神经毒性等。其他不良反应包括肿瘤溶解综合征、血细胞减少、感染，低免疫球蛋白血症及乙肝病毒激活等。

目前解决方案主要有：使用糖皮质激素来药物，如甲泼尼龙；使用靶向阻断上调胞因子信号转导通路的药物，如托珠单抗（tocilzumab）；引入“自杀基因”，其基因产物会当 CAR-T 细胞处于不合理的活化时将其清除，避免CAR-T细胞潜在的不良反应等。