当前位置: 首页抗癌知识正文

哪些小细节会影响基因检测的准确性,你知道吗?

作者:小D|2020年12月22日| 浏览:1825

随着基因检测技术的发展推动了精准医学的发展,Sanger、扩增阻滞系统PCR(ARMS-PCR)以及高通量测序(NGS)技术在临床肿瘤精准诊疗中广泛应用,根据检测结果的综合分析可以指导患者用药、分子分型、耐药监测、预后评估等,给患者带来了极大的生存获益。基因检测结果的准确性对于精准诊疗指导尤为重要,在基因检测的各环节中,分析前的样本质控非常重要,分析前误差占检测全部误差的60%-80%。因此,为了保证高质量的检测结果,规范化的样本质控流程不可或缺。今天我们就来聊聊样本质控中那些重要的小细节。

肿瘤常见样本类型

肿瘤基因检测中涉及到的样本类型主要有三大类:组织标本、细胞学标本和血液标本。组织标本包括新鲜组织和FFPE样本,FFPE样本又称为甲醛固定石蜡包埋组织(formalin-fixed,paraffin-embedded),是经过福尔马林固定,石蜡包埋的组织样本,是临床样本常见保存形式。细胞学标本包括恶性胸腔积液、心包积液、脑脊液、腹腔积液等,胸腹水是中晚期患者常见的并发症之一,标本获取较为简单安全,也可作为基因检测的标本。中晚期的患者由于组织取样困难,不能实现病情动态监测,可以采用血液标本进行检测,取样方便且无创。

不同的标本有其自身的特点,应合理进行选择。初治患者优先采用术后切除样本,次优为活检样本,选取肿瘤含量最高的部位;复发或耐药后的患者,若可取到组织样本,优先送检耐药后样本(原发灶或转移灶),若无法获取组织,可送检胸腹水或外周血筛查耐药原因。

任何病变组织或细胞在检测前,均要求有病理医师进一步明确病变组织是否与病理诊断一致,并评价标本有无出血、坏死和不利于核酸检测的前处理(例如含 HCl 的脱钙液处理),避免由于标本处理方法的不当而出现假阴性结果,评估标本中病变细胞(如肿瘤细胞)的总量和比例是否达到检测要求。

组织样本质控要点

不同检测方法对于组织样本的要求不同:Sanger测序灵敏度不高,突变等位基因需≥20%才能检出,一般要求组织样本中肿瘤细胞含量≥50%,该方法不适用于活检或细胞学样本;ARMS-PCR灵敏度高,可检测肿瘤细胞中突变比例为1%甚至更低的突变基因。肿瘤细胞比例尚无统一标准,理想情况下,石蜡样本中肿瘤细胞的比例不应低于50%,新鲜组织样本不低于25%,对于ARMS等敏感性较高的方法,肿瘤细胞的含量和比例可以低一些。具体视所采用的DNA提取方法和突变检测方法的敏感度等而定。

NGS测序对肿瘤细胞占比的要求取决于实验室检测平台,若分析敏感性为5%-10%,考虑到肿瘤异质性及等位基因可能发生在其中一个等位基因上,因此组织细胞中肿瘤细胞的比例至少应为10%-20%。《临床分子病理实验室二代基因测序检测专家共识》中指出:NGS测序组织标本中肿瘤细胞含量建议达到20%以上,低于此标准可富集后检测。选取以肿瘤细胞为主的、没有明显的坏死、黏液和炎性改变的组织进行检测。

处理及保存

 新鲜组织

可提取高质量的DNA和RNA,对采集及保存条件要求也较高,手术切除的组织迅速置于液氮中,保存于液氮罐或-80℃冰箱,这一过程应在手术样本离体后30min内完成,由于组织样本通常需先进行病理学分析,分析完成后尽早将组织置于稳定剂中,避免核酸降解。

FFPE组织

FFPE样本可室温保存数年,尽量选取1年内的样本送检,4℃保存或常温运输。福尔马林的固定易使组织中的核酸(DNA或RNA)发生不同程度的降解和分子间的交联,石蜡的高温渗入过程进一步加速核酸降解。DNA易受到固定的影响,长时间浸泡会导致DNA片段化,不能检出突变。手术组织固定时间一般为24-72h,穿刺活检等样本的固定时间为6-24h。若是提取RNA,组织的固定时间不应超过24h,4℃保存,而不是室温或者更高,可减缓核酸或蛋白的降解。

FFPE样本的制备、提取及分析流程如下:

细胞学标本质控要点

中晚期患者中往往取不到组织进行检测,可考虑采用细胞学标本,其中常用的有胸腔积液或腹腔积液。恶性胸腔积液(malignant pleural effusion, MPE)可能由原发于胸膜的恶性肿瘤或者是转移至胸膜的恶性肿瘤引起,在晚期肺癌中常见,发生率可高达60%,胸水细胞学检查也是临床常用的检查手段。肺癌CSCO指南(2019年)中指出,对于胸腹水或心包积液等细胞学样本在细胞数量充足条件下可制备细胞学样本蜡块,确认肿瘤细胞含量,再进行基因检测。有研究表明,细胞学标本的DNA提取和基于PCR的检测,样本需要包含至少100个恶性肿瘤细胞,尽量不与良性上皮和炎性细胞混合。NGS测序要求肿瘤细胞含量应至少为所含总细胞的10%。对于其他的测序方法,如Sanger测序,由于该方法敏感性较低,肿瘤细胞含量至少为20%。

胸腹水样本提交病理检测后,剩余液体冷藏/冷冻保存,也可在含有细胞成分的离心沉淀中加入含有蛋白质变性剂的缓冲液(AL缓冲液,Qiagen公司)等室温保存。由于细胞学样本中细胞数量较少,需使用高灵敏度的检测方法,其结果解释需格外谨慎。

液体活检

液体活检(Liquid biopsy)是指利用人体体液作为标本来源检测获取肿瘤相关信息的技术,检测对象包括:循环肿瘤DNA(ctDNA)、循环肿瘤细胞(CTC)和外泌体(exosome)。相比于传统的侵入式组织活检,液体活检具有依从性佳、标本易获取、特异性好等优势。其中ctDNA的检测在肿瘤的用药指导、分子分型及耐药监测中广泛应用。

ctDNA是一种存在于血浆或血清、胸水、脑脊液等标本中的细胞外DNA,来源于凋亡或坏死的肿瘤细胞、CTC或肿瘤细胞分泌的外泌体,携带肿瘤特异性基因突变信息,大小通常为100-200bp。2018年发布的《液体活检在临床肿瘤诊疗应用和医学检验实践中的专家共识》(以下简称《液体活检共识》)中对体液标本的选择、采集及预处理进行了建议。

 血浆ctDNA

血浆(plasma)和血清(serum)中均包含少量的ctDNA,而血清标本由于凝血过程中可能存在白细胞裂解导致少量基因组DNA释放进入血清,稀释ctDNA浓度,目前较为公认的是血浆是进行游离DNA检测最理想的样本。《非小细胞肺癌血液EGFR基因检测中国专家共识》中指出,针对EGFR基因检测,相较于血清样本,血浆中ctDNA有更高的检出率。研究显示,肿瘤分期越高,ctDNA检出率越高,即III-IV期肿瘤患者血液中ctDNA含量比I-II期患者的含量更高,更易被检出。建议选择晚期患者外周血样本送检EGFR提高检出率。

胸水上清ctDNA

对于出现恶性胸腔积液晚期肺癌患者来说,无疑出现了另一个可用于基因检测的替代样本选择,但以往利用胸水进行检测,往往使用胸水沉淀物,需要样本中存在足够的肿瘤细胞,这就限制了胸水的广泛应用。有研究证实,胸水上清的驱动突变检出率更优于胸水沉淀物,且对于细胞学阴性的胸腔积液也适用,为此类患者在检测样本的选择上开启了一扇“希望之窗”。

胸水上清是胸水离心后的上清液,与血浆相比ctDNA浓度更高,在肺癌,乳腺癌和胃肠道癌等癌种中较常见。有研究表明,胸水上清ctDNA具有更高的肿瘤特有突变检出率和敏感性。按照肿瘤特异性突变检出率排序:肿瘤组织(100%)>胸水上清(98%)>胸水细胞(89%)>外周血(86%),在有组织的情况下优先选用组织标本。

体液标本选择的一般规律

《液体活检共识》对体液标本的选择在送检肿瘤基因检测前,需综合考虑患者病灶累及部位、转移情况、不同体液标本特征,优先选择液体活检靶标最易检出部位标本。针对广泛腹腔/盆腔转移患者可优选腹水;中枢转移性肿瘤可优选脑脊液,难以判断的患者可联合多种体液检测结果,提供多维患者诊疗图谱。

表1 体液标本选择一般规律

采集和预处理

体液标本中信息源含量极其微量,且存在较强的背景干扰如背景细胞或核酸对ctDNA和CTC的稀释作用,在预处理过程中应尽量避免并防止对CTC的破坏和对ctDNA片段化以及降解,导致假阴性结果。《液体活检共识》对常见体液标本处理的基本原则进行概述。

 外周血

外周血中最佳检测的标本类型为血浆,最好采用含细胞稳定剂的抗凝管或者EDTA抗凝管采集血液。考虑到临床实践的方便性,尽量采用含细胞稳定剂的抗凝管,如Streck管。

常规采集流程:肘部静脉血10ml,可分离出约4-5ml血浆(采血量视具体情况而定,建议不少于10ml,避免因标本量不足导致假阴性结果),避免凝血和溶血。采血后轻柔颠倒8-10次,为保证后续血浆分离及游离DNA提取质量,Streck管禁止冷藏/冷冻血液标本,建议常温保存及运输(6-30℃,可保存3-5天)至指定实验室。建议在7天内进行两步离心完成血浆分离,分离出不含细胞成分的血浆(避免吸入白细胞),可直接进行抽提或保存于-80℃冰箱冻存直至抽提。

注:由于肝素可抑制PCR反应,需禁用肝素抗凝管。

 胸、腹腔积液(胸腹水)

临床医师通过胸膜腔或腹腔穿刺术,采集胸腔积液或腹腔积液20 ml置于预添加EDTA抗凝剂的无菌容器中(采集量视具体情况而定),采集完毕应即刻送至检测实验室,常温保存。建议2h内完成两步离心分离上清(同血浆分离步骤),分离后的上清可直接进行抽提或保存-80℃冰箱直至抽提。

 脑脊液

临床医生通过腰椎穿刺术,采集脑脊液2-5ml置于无菌容器(采集量视具体情况而定),采集完毕应即刻送至检测实验室,常温保存。建议2h内完成两步离心分离上清(同血浆分离步骤),分离后的上清可直接进行抽提或保存于-80℃冰箱直至抽提。

 外周血CTC

肘部采集静脉血6ml(为避免上皮细胞污染,需弃去前2ml血液),避免凝血或溶血。采血完毕应即刻送至检测实验室,常温保存运输。要求选择专用细胞保存采血管(ACD管),要求48h内送达实验室。

分析前质量管理

标本采集时的患者状态将影响检测结果,如基础状态、治疗方案、肿瘤转移情况,因此选择适当的采集时间点极为重要。确保患者在标本采集前两周前未进行化疗或放疗,以避免假阴性的结果;对存在严重炎症的肿瘤患者,建议在白细胞恢复正常水平后再行检测,以避免假阴性结果;推荐早晨空腹采取静脉血,以防止油脂影响DNA提取和检测。

标本采集、运输和预处理严格按照液体活检标准操作程序(standard operating procedure,SOP)实施,避免标本存在溶血、凝块和脂血等情况,以保证后续检测结果的准确和可靠:

(1)溶血

标本溶血是实验室最常见的误差来源,是标本拒收或重新采样的主要原因。严重溶血下,标本不可用,血红蛋白及其代谢产物可能抑制Taq酶活性,使PCR扩增效率明显降低。《溶血指数质量指标建立与标本管理专家共识》中指出,实验室应开展溶血质量标准监测,以降低标本溶血缺陷。标本溶血主要发生在标本采集过程,也可发生在转运、实验室离心处理过程。静脉血标本溶血常见缺陷类型分析:

1) 标本采集:采血损伤(如反复进针、血肿部位采血),从静脉留置针、输液管、中心静脉导管等血管通路装置采血;注射器采血;未首选肘前正中静脉、头静脉及贵要静脉;使用细针头;消毒剂未干;止血带使用超过1 min;未及时混匀或剧烈震荡混匀;采血量不足,未达采血管真空度量刻度;真空采血管分离胶质量差;使用大容量真空采血管等。

2) 标本转运:气动传输过程中剧烈震荡;转运时间长;转运车温度过高、剧烈震荡等。

3) 实验室标本处理:标本保存时间过长;标本保存温度过高;未及时离心;离心前血液未完全凝固;离心温度过高、速度过快;再次离心等。

4) 体内溶血:如自身免疫性溶血症;

(2)脂血

血脂过高,使血浆呈乳白色,低密度脂蛋白对荧光有屏蔽和吸收作用,故对PCR有干扰。

参考文献:

 

1. 《肿瘤个体化治疗检测技术指南(试行)》

2.  中国临床肿瘤学会(CSCO)原发性肺癌诊疗指南(2019年)

3. Fassunke Jana,Ball Markus,Engels Marianne,[Molecular diagnostics of cytological specimens].[J] .Pathologe, 2020, 41: 39-45.

4. Tong L, Ding N, Tong X, Li J, Zhang Y, Wang X, Xu X, Ye M, Li C, Wu X, Bao H, Zhang X, Hong Q, Song Y, Shao YW, Bai C, Zhou J, Hu J. Tumor-derived DNA from pleural effusion supernatant as a promising alternative to tumor tissue in genomic profiling of advanced lung cancer. Theranostics 2019; 9(19):5532-5541.

5. 中华医学会检验医学分会, 国家卫生健康委员会临床检验中心. 液体活检在临床肿瘤诊疗应用和医学检验实践中的专家共识[J]. 中华检验医学杂志, 2018, 41(10):724.

6. 佚名. 液体活检:规范与精准同行[J]. 循证医学, 2016, 16(4):193-197.

7. Bettegowda C,Sausen M,J. Leary R,et al., Detection of Circulating Tumor DNA in Early- and Late-Stage Human Malignancies[J].Sci Transl Med,2014, 6(224):224-247.

8. 《乳腺癌HER2检测指南(2019版)》编写组. 乳腺癌HER2检测指南(2019版)[J]. 中华病理学杂志, 2019, 48(3):169-175.

9. 《临床分子病理实验室二代基因测序检测专家共识》编写组. 临床分子病理实验室二代基因测序检测专家共识[J]. 中华病理学杂志, 2017, 046(003):145-148.

10. 临床标本溶血检测与检验结果报告专家共识.2019.06

 

 

本文仅供医学药学专业人士阅读

本文来源: 安龙基因 由小D 发表,转载请注明来源!如有侵权请联系删除
90%的癌症患者,都不知道如何延长自己的生存期
上一篇

90%的癌症患者,都不知道如何延长自己的生存期

止痛药物疗效不佳?这些微创介入治疗你必须知道
下一篇

止痛药物疗效不佳?这些微创介入治疗你必须知道

阅读相关文章